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Posso peletizar o DNA de volta do estado dissolvido?

Posso peletizar o DNA de volta do estado dissolvido?


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Eu tenho um pellet de plasmídeo dissolvido em água. Posso peletizar novamente centrifugando a 13000 rpm? Se não, por quê?


Não, você não pode sedimentar o DNA dissolvido com ultracentrifugação.

sim, você pode recuperar um pellet com tratamentos adicionais, da mesma forma como o obteve inicialmente; apenas em vez de sua entrada ser células homogeneizadas, ou tecido, ou extrato, ou seja o que for que você usou para obter seu DNA, agora seria apenas sua solução aquosa de DNA.

Por exemplo, você pode ter realizado uma extração de TRIzol para separar seu DNA em uma fase aquosa, antes de girá-lo através de mini colunas de preparação para eluir seu DNA purificado em água. Você poderia realizar o procedimento novamente e obter seu pellet mais uma vez após a etapa final de precipitação com álcool (etanol ou isopropanol).

A ideia principal com a peletização de DNA (ou qualquer ácido nucléico) é torná-lo insolúvel; isto é conseguido com o uso de álcoois e sais. Se for solúvel, os ácidos nucléicos não podem 'sair da solução' para formar um pellet.


O que é precipitação de DNA? (com fotos)

A precipitação do ácido desoxirribonucléico (DNA) é uma etapa fundamental no isolamento e purificação do material genético na ciência. Geralmente, uma amostra de tecido biológico contém DNA ou RNA junto com o resto do corpo do organismo. Para testar o DNA, um cientista precisa separar o DNA de todas as outras substâncias. A precipitação do DNA refere-se especificamente a uma etapa que envolve a separação do DNA dissolvido do líquido em que está dissolvido. Os métodos comuns de precipitação do DNA incluem a adição de etanol, ispropanol ou glicogênio ao líquido, o que faz o DNA solidificar em pedaços e cair para o parte inferior da amostra de líquido. & # 13

Os passos iniciais na purificação do DNA de uma amostra podem ser tão simples quanto esmagar as folhas em uma tigela para quebrar parte da estrutura. Em seguida, a mistura pode ser decomposta com produtos químicos ou enzimas que deixam o DNA intacto. Normalmente, os geneticistas usam uma centrífuga para ajudar a separar os diferentes componentes de uma amostra. Esta é uma máquina que gira uma amostra de forma que o componente mais pesado desça para o fundo e o mais leve suba para o topo. & # 13

Ao remover vários componentes indesejados, o geneticista geralmente fica com um líquido transparente que contém o material genético. Ele então precisa retirar o DNA dissolvido naquele líquido e descartar o líquido e as outras substâncias contidas no líquido. A precipitação do DNA é a maneira pela qual isso é feito. Na maioria das vezes, o cientista precisa adicionar uma substância química ao líquido para realizar a precipitação do DNA. & # 13

Etanol ou isopropanol, que são formas de álcool e se enquadram no grupo de solventes químicos, são os produtos químicos mais comuns usados ​​para a precipitação do DNA. O glicogênio é outra substância que pode precipitar o DNA, mas é menos comumente usada, além de precipitar baixas concentrações de material genético. Quando essas substâncias químicas se misturam com o DNA dissolvido, sua química permite que alterem a maneira como o DNA se ajusta ao ambiente. Enquanto antes o DNA se misturava facilmente com o líquido, após a adição do produto químico, ele para de se ligar ao líquido e, em vez disso, forma um sólido. & # 13

Este sólido é normalmente esbranquiçado e se aglomera. Como parte do sólido ainda está em pequenas partículas, no entanto, o cientista geralmente coloca a amostra em uma centrífuga para girar todos os sólidos juntos em uma pelota no fundo do tubo de amostra. Esta é a forma purificada do DNA originalmente presente na amostra, que é útil para testes. Geralmente, o líquido em que o grânulo é suspenso é removido do tubo, e o grânulo também pode ser seco para permitir que os produtos químicos evaporem, a fim de tornar o grânulo o mais puro possível.


DNA: informações básicas

O que o DNA representa?

DNA significa ácido desoxirribonucléico.

O DNA é uma longa molécula com a forma de uma dupla hélice - duas espirais se torcendo. Essas espirais são a espinha dorsal do DNA e são feitas de açúcares e fosfatos. As espirais são conectadas por produtos químicos conhecidos como bases, que se estendem entre as espirais como os degraus de uma escada. O DNA possui quatro tipos de bases: adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C). A e T sempre se juntam, assim como G e C.

O que o DNA faz?

Nossos genes são feitos de DNA, e o DNA contém nosso código genético único.
Como um livro de receitas ou instruções para lego, o DNA contém as instruções para fazer todas as nossas proteínas, que fazem todas as funções em nossos corpos.

Genes em comum

Você não se parece muito com uma mosca ou um verme. Mas, acredite ou não, você compartilha genes com os dois e com todos os outros seres vivos. Os cientistas estudam os genes em bactérias, peixes-zebra e outros seres vivos para aprender mais sobre os humanos.

Quanto DNA você compartilha com essas coisas vivas?


Por que usamos o detergente líquido?

O líquido de lavar louça estourou e abriu as células dos morangos, liberando o DNA.

Por que usamos o sal?

Isso garante que as proteínas da célula sejam mantidas separadas do DNA.

O que o álcool faz?

Quando as moléculas são insolúveis (incapazes de serem dissolvidas), elas se agrupam e se tornam visíveis. O DNA não é solúvel em álcool, portanto, faz com que as fitas de DNA se aglutinem e se tornem visíveis a olho nu.


Referências

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Rickwood, D. (ed.) Centrifugação: Uma Abordagem Prática (IRL, Oxford, 1983).


  • As células a serem estudadas precisam ser coletadas.
  • Quebrar as membranas celulares para expor o DNA junto com o citoplasma interno (lise celular).
    • Os lipídios da membrana celular e do núcleo são decompostos com detergentes e surfactantes.
    • Quebrando proteínas adicionando uma protease (opcional).
    • Dividindo o RNA adicionando uma RNase (opcional).
      geralmente por etanol gelado ou isopropanol. Uma vez que o DNA é insolúvel nesses álcoois, ele se agregará, dando um pelota após centrifugação. A precipitação de DNA é melhorada pelo aumento da força iônica, geralmente pela adição de acetato de sódio. em que fenoldenatures proteínas na amostra. Após a centrifugação da amostra, as proteínas desnaturadas permanecem na fase orgânica enquanto a fase aquosa contendo o ácido nucleico é misturada com clorofórmio para remover os resíduos de fenol da solução. que se baseia no fato de que os ácidos nucléicos podem se ligar (adsorção) à fase sólida (sílica ou outra) dependendo do pH e da concentração de sal do tampão.
  • Proteínas celulares e histonas ligadas ao DNA podem ser removidas adicionando uma protease ou tendo precipitado as proteínas com sódio ou acetato de amônio, ou extraído com uma mistura de fenol-clorofórmio antes da precipitação do DNA.

    Após o isolamento, o DNA é dissolvido em um tampão ligeiramente alcalino, geralmente em um tampão TE ou em água ultra-pura.

    Alguns dos métodos de extração de DNA mais comuns incluem extração orgânica, extração de Chelex e extração de fase sólida. [3] Esses métodos consistentemente produzem DNA isolado, mas eles diferem tanto na qualidade quanto na quantidade de DNA produzido. Ao selecionar um método de extração de DNA, há vários fatores a serem considerados, incluindo custo, tempo, segurança e risco de contaminação.

    A extração orgânica envolve a adição e a incubação em várias soluções químicas diferentes [3], incluindo uma etapa de lise, uma extração com fenol e clorofórmio, uma precipitação com etanol e etapas de lavagem. A extração orgânica é freqüentemente usada em laboratórios porque é barata e produz grandes quantidades de DNA puro. Embora seja fácil, há muitas etapas envolvidas e leva mais tempo do que outros métodos. Também envolve o uso desfavorável dos produtos químicos tóxicos fenol e clorofórmio, e há um risco aumentado de contaminação devido à transferência do DNA entre vários tubos. [4] Vários protocolos baseados na extração orgânica de DNA foram efetivamente desenvolvidos décadas atrás, [5] embora versões aprimoradas e mais práticas desses protocolos também tenham sido desenvolvidas e publicadas nos últimos anos. [6]

    O método de extração Chelex envolve adicionar a resina Chelex à amostra, ferver a solução e, em seguida, agitá-la no vórtex e centrifugá-la. Os materiais celulares ligam-se às esferas Chelex, enquanto o DNA está disponível no sobrenadante. [4] O método Chelex é muito mais rápido e simples do que a extração orgânica e requer apenas um tubo, o que diminui o risco de contaminação por DNA. Infelizmente, a extração de Chelex não produz tanta quantidade e o DNA produzido é de fita simples, o que significa que só pode ser usado para análises baseadas em PCR e não para RFLP. [4]

    A extração em fase sólida, como o uso de um método de extração baseado em coluna de rotação, tira vantagem do fato de que o DNA se liga à sílica. A amostra contendo DNA é adicionada a uma coluna contendo gel de sílica ou esferas de sílica e sais caotrópicos. Os sais caotrópicos interrompem a ligação de hidrogênio entre as fitas e facilitam a ligação do DNA à sílica, fazendo com que os ácidos nucléicos se tornem hidrofóbicos. Isso expõe os resíduos de fosfato para que fiquem disponíveis para adsorção. [7] O DNA se liga à sílica, enquanto o resto da solução é lavado com etanol para remover sais caotrópicos e outros constituintes desnecessários. [3] O DNA pode então ser reidratado com soluções aquosas com baixo teor de sal, permitindo a eluição do DNA dos grânulos.

    Este método produz DNA de alta qualidade, em grande parte de fita dupla, que pode ser usado para análise de PCR e RFLP. Este procedimento pode ser automatizado [4] e possui alto rendimento, embora inferior ao método fenol-clorofórmio. Este é um método de uma etapa, ou seja, todo o procedimento é concluído em um tubo. Isso diminui o risco de contaminação, tornando-o muito útil para a extração forense de DNA. Vários kits comerciais de extração em fase sólida são fabricados e comercializados por diferentes empresas, o único problema é que eles são mais caros do que a extração orgânica ou a extração Chelex.

    Devem ser escolhidas técnicas específicas para o isolamento do DNA de algumas amostras. As amostras típicas com isolamento de DNA complicado são:

    • amostras arqueológicas contendo DNA parcialmente degradado, veja DNA antigo [8]
    • amostras contendo inibidores de procedimentos de análise subsequentes, mais notavelmente inibidores de PCR, como ácido húmico do solo, índigo e outros corantes de tecido ou hemoglobina no sangue
    • amostras de microrganismos com parede celular espessa, por exemplo levedura
    • amostras contendo DNA misto de fontes múltiplas

    O DNA extracromossômico é geralmente fácil de isolar, especialmente os plasmídeos podem ser facilmente isolados por lise celular seguida pela precipitação de proteínas, que retém o DNA cromossômico na fração insolúvel e, após a centrifugação, o DNA plasmídico pode ser purificado a partir da fração solúvel.

    A Extração de DNA Hirt é um isolamento de todo o DNA extracromossômico em uma célula de mamífero. O processo de extração de Hirt elimina o DNA nuclear de alto peso molecular, deixando apenas o DNA mitocondrial de baixo peso molecular e quaisquer epissomas virais presentes na célula.

    Um indicador de difenilamina (DPA) irá confirmar a presença de DNA. Este procedimento envolve a hidrólise química do DNA: quando aquecido (por exemplo, ≥95 ° C) em ácido, a reação requer um açúcar desoxirribose e, portanto, é específica para o DNA. Nessas condições, a 2-desoxirribose é convertida em w-hidroxilevulinil aldeído, que reage com o composto, difenilamina, para produzir um composto de cor azul. A concentração de DNA pode ser determinada medindo a intensidade de absorbância da solução a 600 nm com um espectrofotômetro e comparando com uma curva padrão de concentrações conhecidas de DNA.

    A medição da intensidade de absorbância da solução de DNA em comprimentos de onda 260 nm e 280 nm é usada como medida da pureza do DNA. O DNA pode ser quantificado cortando o DNA com uma enzima de restrição, executando-o em um gel de agarose, coloração com brometo de etídio (EtBr) ou uma coloração diferente e comparando a intensidade do DNA com um marcador de DNA de concentração conhecida.

    Usando a técnica de Southern blot, este DNA quantificado pode ser isolado e examinado posteriormente usando análise de PCR e RFLP. Esses procedimentos permitem a diferenciação das sequências repetidas dentro do genoma. São essas técnicas que os cientistas forenses usam para comparação, identificação e análise.

    Neste método, os núcleos das plantas são isolados triturando fisicamente os tecidos e reconstituindo os núcleos intactos em um único Tampão de Isolamento Nuclear (NIB). Os DNAs de plastídio são liberados de organelas e eliminados com um tampão osmótico por lavagem e centrifugação. Os núcleos purificados são então lisados ​​e posteriormente limpos por extração orgânica, e o DNA genômico é precipitado com alta concentração de CTAB. O gDNA altamente puro e de alto peso molecular é extraído dos núcleos, dissolvido em um tampão de alto pH, permitindo o armazenamento estável a longo prazo. [9]


    Biologia da simbiose animal-dinoflagelado

    Início, estabilidade e quebra da simbiose

    Zooxanthellae são encontradas em muitas espécies de corais, abrangendo inúmeros gêneros e famílias. De cima para baixo: Fungia sp. (Fungiidae), Caulastraea sp. (agora um membro dos Merulinidae) e Trachyphyllia geoffroyi (Trachyphylliidae).

    Quando Symbiodinium vivem livremente no oceano, eles existem em duas formas intercambiáveis ​​(Freudenthal 1962). O primeiro é um zoósporo móvel, que se impulsiona para a frente com um flagelo. A segunda forma é um cisto vegetativo e não é móvel, pois não tem flagelo. Os cistos vegetativos podem se reproduzir assexuadamente, quando são de vida livre ou em simbiose, por divisão celular que produz duas ou três células-filhas. Há indícios de que Symbiodinium spp. também pode se reproduzir sexualmente (Stat et al. 2006). O cisto vegetativo é a forma dominante quando os dinoflagelados vivem em simbiose com animais, e as evidências sugerem que o animal hospedeiro usa sinalização química para mantê-los neste estado imóvel (Koike et al. 2004). Na maioria dos casos de simbiose, as zooxantelas vivem dentro de uma célula hospedeira animal, delimitada por uma membrana animal, conhecida como membrana simbiosômica (Venn et al. 2008). Em tridacnídeos, entretanto, as zooxantelas vivem extracelularmente, entre as próprias células dos moluscos (Ishikura et al. 1999). Nos corais, as zooxantelas residem na gastroderme, a camada de células que cobre o celentério, ou estômago dos pólipos. Nos últimos anos, os mecanismos subjacentes ao início da simbiose coral-zooxanthellae foram estudados em laboratório. Atualmente, os cientistas dividiram a simbiose entre cnidários e algas em seis fases: contato inicial, envolvimento, classificação, proliferação, estabilidade e finalmente disfunção (Davy et al. 2012).

    Visão geral das seis fases conhecidas da simbiose cnidário-algas. 1: contato superficial inicial entre a zooxantela e a célula hospedeira animal 2: engolfamento do simbionte pela célula hospedeira 3: classificação dos simbiontes, agora envolvidos por uma membrana de origem do hospedeiro, levando à rejeição ou aceitação do simbionte 4: crescimento do simbionte via divisão celular no tecido hospedeiro 5: estabilidade, com uma população simbionte estável 6: disfunção e quebra da simbiose devido ao estresse. Redesenhado de Davy et al. (2012).

    Primeiro, as zooxantelas de vida livre precisam encontrar hospedeiros potenciais, como os corais. Embora algumas espécies de corais transfiram suas zooxantelas para seus descendentes por meio de ovos, um processo chamado transmissão vertical, muitas espécies precisam adquirir novos simbiontes a cada geração. Larvas e pólipos de coral o fazem retirando-os da coluna d'água, o que é chamado de transmissão horizontal. O reconhecimento das zooxantelas como simbiontes potenciais pelos corais não é completamente compreendido, mas requer uma miríade de moléculas sinalizadoras presentes na superfície celular de ambos os parceiros. Depois que as células do coral & # 8217s reconheceram com sucesso zooxantelas potencialmente compatíveis, as células as engolfam por meio de um processo chamado fagocitose (do grego fago, ou para devorar, quitos, ou celular, e osis, processo de significado). Em seguida, um processo de classificação começa, levando à digestão de zooxantelas indesejadas e à persistência de outras. A preferência do coral por um tipo específico de zooxantela, ou clado, depende de muitos fatores, incluindo espécies. Quando um coral encontra zooxantelas incompatíveis, uma resposta imunológica é disparada e os dinoflagelados são destruídos e expulsos. Zooxantelas adequadas irão proliferar em todo o gastroderme do coral e uma simbiose estável ocorrerá. Uma vez que uma simbiose estável é estabelecida, as zooxantelas e os corais são capazes de se beneficiar mutuamente da colaboração trocando nutrientes (veja também abaixo). No entanto, quando o coral está estressado, por elevadas temperaturas da água ou alta intensidade de luz, por exemplo, pode ocorrer um fenômeno conhecido como branqueamento do coral. Isso é causado pela disfunção da simbiose, a sexta e última fase conhecida. Acredita-se que a disfunção durante o calor ou estresse de luz ocorra devido a danos sofridos pela maquinaria fotossintética (ou fotossistemas) das zooxantelas, que faz com que moléculas tóxicas fluam para o tecido do coral (Venn et al. 2008). Essas moléculas tóxicas são chamadas de espécies reativas de oxigênio e incluem radicais superóxidos (O2 & # 8211) e peróxido de hidrogênio (H2O2) Em resposta a essas toxinas, as zooxantelas são provavelmente destruídas e ejetadas das células gastrodérmicas e, em seguida, pela boca do coral.

    Mecanismo que se acredita ser a base da quebra da simbiose coral. O estresse térmico e luminoso causam danos aos fotossistemas dentro da zooxantela, levando à produção de radicais superoxigênio (O2-) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Isso causa danos à zooxantela e à célula hospedeira do coral, o que desencadeia a destruição e expulsão da zooxantela e, finalmente, o branqueamento. Redesenhado de Venn et al. (2008).

    A interrupção da simbiose animal-dinoflagelado por fatores ambientais não é nada trivial. Quando os corais estão em um estado branqueado, eles não são mais sustentados pelos nutrientes vitais de suas zooxantelas e precisam readquirir seus simbiontes rapidamente para permanecer vivos. Infelizmente, verões longos e quentes costumam impedir que os corais façam exatamente isso, e segue-se uma enorme mortalidade dos corais. Em aquários, observações semelhantes foram feitas. Muitos aquaristas viram os efeitos do calor e do estresse da luz em casa, durante os verões quentes ou depois que as luzes do aquário foram atualizadas. Após vários dias de aumento da temperatura da água ou da intensidade da luz, os corais e anêmonas podem branquear completamente, resultando em um aquário pálido e incolor. Portanto, é importante manter a temperatura do aquário estável e aumentar a intensidade da luz lentamente para permitir que as zooxantelas se adaptem.

    Sabe-se que a sensibilidade das zooxantelas ao calor e ao estresse luminoso varia entre os clados, sendo o clado D o mais tolerante ao calor (Baker et al. 2004). Isso é possivelmente devido ao fato de que essas zooxantelas têm membranas fotossintéticas que permanecem estáveis ​​mesmo em temperaturas em torno de 93 ° F (32 ° C), e não liberam espécies tóxicas de oxigênio reativo no tecido coral a esta temperatura elevada (Tchernov et al. 2004 ) Isso explica por que alguns corais branqueiam durante os verões quentes e outros não.

    Troca de nutrientes dentro da simbiose

    Enquanto a simbiose entre zooxantelas e corais estiver intacta, ambos os parceiros se beneficiam de uma intrincada troca de nutrientes. As células do coral fornecem às zooxantelas carbono e nitrogênio inorgânico (dióxido de carbono, amônio), produzidos pela quebra de compostos orgânicos obtidos das zooxantelas (glicerol, glicose, aminoácidos, lipídios) e da água circundante (plâncton, detritos, orgânicos dissolvidos matéria). As zooxantelas, por sua vez, utilizam compostos inorgânicos obtidos do coral e da água do mar (dióxido de carbono, bicarbonato, amônio, nitrato, hidrogenofosfato) para produzir moléculas orgânicas por meio do processo de fotossíntese. Uma parte importante dessas moléculas orgânicas, agora chamadas de fotossintatos, é então transferida de volta para o hospedeiro. Essa troca de nutrientes entre os corais e as zooxantelas permite que eles usem os nutrientes escassamente disponíveis no oceano de forma eficiente. A translocação de compostos ricos em energia das zooxantelas para seus hospedeiros permitiu que os corais construíssem vastos recifes, por meio da secreção de esqueletos de carbonato de cálcio.

    Visão geral da troca de nutrientes entre um único coral e a célula zooxanthella. O coral absorve compostos orgânicos como plâncton, detritos (ou matéria orgânica particulada, POM), uréia, aminoácidos e glicose (ou matéria orgânica dissolvida, DOM) da água do mar. Além disso, recebe moléculas orgânicas das zooxantelas, como o glicerol. A célula de coral decompõe-se em amônio e dióxido de carbono, que são subsequentemente absorvidos pela zooxantela. A zooxantela também absorve compostos inorgânicos da água, como amônio (NH4 +), nitrato (NO3-), hidrogenofosfato (HPO42-), bicarbonato (HCO3-) e dióxido de carbono (CO2), e os converte em moléculas orgânicas, principalmente através da fotossíntese. Uma parte importante desses compostos é novamente exsudada na célula hospedeira do coral. Este ciclo de nutrientes entre as células hospedeiras do coral e suas zooxantelas simbióticas permite que os corais cresçam em ambientes pobres em nutrientes. Redesenhado de Davy et al. (2012).

    É claro que as zooxantelas não transferem simplesmente qualquer excesso de substâncias para seu hospedeiro coral. A liberação de fotossintatos das zooxantelas é habilmente induzida pelo coral com o chamado & # 8220host release factor & # 8221, ou HRF. Este HRF é uma substância produzida pelo coral, possivelmente um coquetel de aminoácidos específicos, que desencadeia a liberação de glicerol e glicose nutritivos pelas zooxantelas (Gates et al. 1995 Wang e Douglas 1997). Na verdade, quando uma gota de pasta de tecido coral é adicionada a um Symbiodinium cultura, ele irá induzir rapidamente a liberação de nutrientes pelos dinoflagelados (Trench 1971). No entanto, Davy et al. (2012) apontam que o HRF não deve ser generalizado entre as espécies hospedeiras, pois as evidências sugerem que diferentes espécies podem usar diferentes tipos de HRF & # 8217s.

    Embora os corais recebam quantidades significativas de compostos orgânicos de suas zooxantelas, a pesquisa sugere fortemente que uma fonte externa de alimento é necessária para sustentar o crescimento ideal (revisado por Houlbrèque e Ferrier-Pagès 2009). Isso ocorre porque os corais requerem proteínas e lipídios adicionais para crescer o tecido e a matriz orgânica, um & # 8220scaffold & # 8221 proteináceo que fornece locais para os cristais de carbonato de cálcio precipitarem. Fornecer aos corais um lote diário de zooplâncton, como copépodes ou náuplios de artémia, não apenas os fornece nutrição, o ligeiro aumento de nutrientes inorgânicos também alimentará as zooxantelas. Além disso, o ciclo de nutrientes dentro da simbiose é estimulado. Alguns aquários são tão desprovidos de nutrientes, devido ao uso de filtração pesada combinada com alimentação escassa, que as zooxantelas param de crescer e morrem. Isso faz com que os corais pareçam branqueados e, quando isso ocorre, é essencial que a taxa de filtração seja reduzida e / ou aumente a alimentação.

    Um coral é suspenso por um fio para pesagem subaquática ou flutuante.


    INTRODUÇÃO

    Avanços recentes na pesquisa em distúrbios genômicos exigiram a coleta de grandes quantidades de DNA de boa qualidade que precisa ser obtido de diferentes fontes de amostra. A tipagem de DNA é atualmente o método mais validado para a identificação pessoal de manchas de fluidos corporais humanos encontradas em cenas de crime. Em uma ampla variedade de estudos genéticos, o método comumente usado é obter DNA genômico de células nucleadas de sangue periférico como resultado da invasividade dessa abordagem, podendo ser difícil obter amostras dos sujeitos do estudo. 1, 2 Os esquemas de isolamento têm sido enfadonhos e os tempos totais de análise também têm sido bastante longos. Outras fontes alternativas de isolamento de DNA incluem célula bucal, cabelo com folículo e urina, que são mais fáceis de obter de maneira não invasiva do que por coleta de sangue invasiva. 2 A coleta de células bucais pode ser realizada facilmente com um cotonete bucal ou com um procedimento de bochecho. 3 O isolamento de DNA usando esfregaços bucais oferece muitas vantagens, como processamento econômico, menor necessidade de volume de amostra, arquivamento de longo prazo e adequação de autocoleção. É mais confortável para o paciente, e os esfregaços bucais fornecem DNA suficiente para os PCRs, pois exigem apenas alguns nanogramas de DNA. 3

    O cabelo humano é um dos materiais biológicos mais comuns associados a investigações legais e tem sido usado para o trabalho populacional baseado em estatísticas e análises baseadas em DNA em criminologia. 4 O método mais valioso de teste de DNA é a análise de repetição curta em tandem de DNA nuclear. 5 Isso é possível quando a porção da raiz do cabelo e / ou tecido aderente está presente. No entanto, os fios de cabelo telógenos (queda de cabelo), muitas vezes associados à cena de um crime, podem não conter nenhum material nuclear. 5 A mitocôndria celular e o DNA mitocondrial (mtDNA) ainda permanecem intactos, 5, 6 enquanto o núcleo se degrada à medida que a haste do cabelo endurece durante a queratinização, e a análise do mtDNA é viável a partir do cabelo queratinizado. Infelizmente, a natureza rica em proteínas das amostras de cabelo requer etapas adicionais para quebrar o eixo e liberar o DNA (como a fragmentação usando um moedor de vidro microscópico, seguido por uma extração de solvente orgânico) 7 & # x02013 9, expondo assim a amostra a maior risco de contaminação. A investigação forense de manchas de urina humana é de grande importância para identificar a localização exata de um crime e o tipo de morte. 10 A urina humana é uma amostra adequada para análises toxicológicas em testes de dopagem e triagem de drogas. 11

    No entanto, devido às dificuldades práticas e razões metodológicas, é essencial otimizar as condições para maximizar o rendimento e a pureza do DNA obtido de diferentes tipos de amostras usando vários métodos. Um método simplificado, demonstrado no presente estudo, para a extração de DNA de fios de cabelo que reduz etapas desnecessárias praticamente elimina a contaminação de DNA e também conserva substancialmente o tempo de duração da análise que seria útil tanto para a comunidade forense quanto para a comunidade de pesquisa de base populacional. Além disso, a necessidade de menor volume de amostra, juntamente com a coleta de amostra de uma maneira não invasiva, permite a amostragem pediátrica que se manifesta prontamente em um recrutamento mais amplo de estudos em estudos de caso de base populacional. Além disso, pode-se considerar o desenvolvimento deste método simplificado, pois pode ser aplicado como uma ferramenta de diagnóstico médico com análise de DNA que pode ser feita em uma escala de tempo razoavelmente curta (& # x0223c8 h) para detectar estados de doença, que o diagnóstico médico atual campo deseja avidamente.


    Resíduos de nitrogênio em pássaros e répteis: ácido úrico

    Aves e répteis desenvolveram a capacidade de converter amônia tóxica em ácido úrico ou guanina, em vez de ureia.

    Objetivos de aprendizado

    Compare o principal subproduto do metabolismo da amônia em mamíferos com o de pássaros e répteis

    Principais vantagens

    Pontos chave

    • Resíduos de nitrogênio no corpo tendem a formar amônia tóxica, que deve ser excretada.
    • Mamíferos como os humanos excretam uréia, enquanto pássaros, répteis e alguns invertebrados terrestres produzem ácido úrico como resíduo.
    • Os organismos uricotélicos tendem a excretar resíduos de ácido úrico na forma de uma pasta ou pó branco.
    • A conversão de amônia em ácido úrico consome mais energia do que a conversão de amônia em uréia.
    • Produzir ácido úrico em vez de ureia é vantajoso porque é menos tóxico e reduz a perda de água e a necessidade subsequente de água.

    Termos chave

    • ureia: um composto orgânico solúvel em água, CO (NH2) 2, formado pelo metabolismo de proteínas e excretado na urina
    • guano: excrementos de aves marinhas, morcegos que vivem em cavernas, pinípedes ou pássaros de maneira mais geral
    • purina: qualquer um de uma classe de base heterocíclica orgânica contendo anéis de pirimidina e imidazol fundidos, eles são componentes de ácidos nucleicos
    • xantina: um precursor do ácido úrico encontrado em muitos órgãos do corpo
    • hipoxantina: um intermediário na biossíntese de ácido úrico
    • ácido úrico: um composto fenólico heterocíclico bicíclico, formado no corpo pelo metabolismo de proteínas e excretado na urina

    Resíduos de nitrogênio em pássaros e répteis: ácido úrico

    Das quatro macromoléculas principais nos sistemas biológicos, tanto as proteínas quanto os ácidos nucléicos contêm nitrogênio. Durante o catabolismo, ou decomposição, de macromoléculas contendo nitrogênio, carbono, hidrogênio e oxigênio são extraídos e armazenados na forma de carboidratos e gorduras. O excesso de nitrogênio é excretado do corpo. Nitrogenous wastes tend to form toxic ammonia, which raises the pH of body fluids. The formation of ammonia itself requires energy in the form of ATP and large quantities of water to dilute it out of a biological system.

    While aquatic animals can easily excrete ammonia into their watery surroundings, terrestrial animals have evolved special mechanisms to eliminate the toxic ammonia from their systems. The animals must detoxify ammonia by converting it into a relatively-nontoxic form such as urea or uric acid.

    Nitrogen excretion: Nitrogenous waste is excreted in different forms by different species. These include (a) ammonia, (b) urea, and (c) uric acid.

    Birds, reptiles, and most terrestrial arthropods, such as insects, are called uricothelic organisms because they convert toxic ammonia to uric acid or the closely-related compound guanine (guano), rather than urea. In contrast, mammals (including humans) produce urea from ammonia however, they also form some uric acid during the breakdown of nucleic acids. In this case, uric acid is excreted in urine instead of in feces, as is done in birds and reptiles.

    Uric acid is a compound similar to purines found in nucleic acids. It is water insoluble and tends to form a white paste or powder. The production of uric acid involves a complex metabolic pathway that is energetically costly in comparison to processing of other nitrogenous wastes such as urea (from the urea cycle) or ammonia however, it has the advantages of reducing water loss and, hence, reducing the need for water.

    Uric acid is also less toxic than ammonia or urea. It contains four nitrogen atoms only a small amount of water is needed for its excretion. Out of solute, it precipitates and forms crystals. The enzyme xanthine oxidase makes uric acid from xanthine and hypoxanthine, which in turn are produced from other purines. Xanthine oxidase is a large enzyme whose active site consists of the metal, molybdenum, bound to sulfur and oxygen. Uric acid is released in hypoxic conditions.


    Can I pellet DNA back from dissolved state? - Biologia

    A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species and Ampelopsis .

    Lodhi, Muhammad A., Guang-Ning Ye, Norman F. Weeden and Bruce I. Reisch. 1994.

    Plant Molecular Biology Reporter 12(1): 6-13.

    Department of Horticultural Sciences, New York State Agricultural Experiment Station, Cornell University, Geneva, NY 14456.

    Key Words: DNA extraction, Vitis sp., polyphenols, polysaccharides , RAPD, restriction digestion.

    A quick, simple and reliable DNA extraction method for grapevine species, hybrids and Ampelopsis ( Vitaceae ) has been developed. This method is a modification of Doyle and Doyle (1990). It is a CTAB-based extraction procedure modified by the use of NaCl to remove polysaccharides and PVP to eliminate polyphenols during DNA purification. The method also has been used successfully for extraction of total DNA from other fruit species such as apple ( Malus domestica ), apricot ( Prunus armeniaca ), cherry ( Prunus avium ), peach ( Prunus persica ), plum ( Prunus domestica ) and raspberry ( Rubus idaeus ). DNA yield from this procedure is high (up to 1 mg/g of leaf tissue). DNA is completely digestible with restriction endonucleases and amplifiable in the polymerase chain reaction (PCR), indicating freedom from common contaminating compounds.

    Vitis vinifera and related species have been the subject of extensive genetic studies due to their worldwide cultivation and importance. Recently this plant has been used for gene mapping (Yamamoto et al., 1991 Mauro et al., 1992 Weeden et al., 1992 Lodhi et al., 1992a 1992b1993 Hain et al., 1993), genetic transformation (Baribault et al., 1989 Baribault et al., 1990 Hébert et al., 1993), and DNA fingerprinting (Striem et al., 1990 Bourquin et al., 1991). The relatively small genome size of Vitis vinifera (0.50 pg/C) compared to many other perennial plant species (Arumuganathan and Earle, 1991) should facilitate molecular genetic studies of Vitis . However, DNA extraction from grapevine has been difficult due to the presence of contaminants such as polyphenols and polysaccharides. These compounds have also been reported to cause difficulty in DNA purification in other plant species polysaccharides (Murray and Thompson, 1980 Fang et al., 1992) polyphenolic compounds (Katterman and Shattuck, 1983 Couch and Fritz, 1990 Howland et al. 1991 Collins and Symons, 1992) and sticky and resinous materials (Webb and Knapp, 1990). The presence of these contaminants in DNA preparations often makes the samples viscous and renders DNA unrestrictable in endonuclease digestion and unamplifiable in PCR. The existing DNA extraction protocols often produce unsatisfactory yields and/or quality (Bourquin et al., 1991 Collins and Symons, 1992).

    Here we report a simple, inexpensive and quick DNA extraction procedure for grapevine Vitis species, hybrids and Ampelopsis . This procedure purifies greater amounts of clean DNA which can be amplified via PCR or digested with endonucleases.

    See Table I for the source of plant material used in this study.

    Extraction buffer: 20 mM sodium EDTA and 100 mM Tris-HCl, adjust pH to 8.0 with HCl, add 1.4 M NaCl and 2.0% (w/v) CTAB (cetyltrimethylammonium bromide). Dissolve CTAB by heating to π C. Store at 37 C. Add 0.2 % of ß-mercaptoethanol just before use.

    TE buffer: 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA, adjust pH to 8.0 and autoclave

    RNAase A (Sigma R9009: 10 mg/mL)

    • Collect unexpanded young leaves in liquid nitrogen or on ice and store at or below -70°C until used. Avoid thawing before grinding the leaf tissue. Grind 0.5 g of leaves using mortar and pestle in the presence of liquid nitrogen. Although leaves should be thoroughly crushed before adding extraction buffer, it is important not to grind the leaves into a very fine powder as it results in shearing of DNA.

    • Add 5 mL of extraction buffer to the ground leaves and mix in the mortar.

    • Pour the slurry into clean 15 mL polypropylene centrifuge tubes (Laboratory Product Sales, Rochester, New York LX 4109), rinse the mortar and pestle with 1 mL of extraction buffer and add to the original extract.

    • Add 50 mg polyvinylpolypyrrolidone (PVP), (Sigma, P6755) and invert the tubes several times to mix thoroughly with the leaf slurry (100 mg PVP/g leaf tissue).

    • Incubate at 60°C for 25 minutes and cool to room temperature.

    • Add 6 mL of chloroform:octanol and mix gently by inverting the tubes 20 to 25 times to form an emulsion.

    • Spin at 6000 rpm for 15 minutes in a table top centrifuge at room temperature.

    • Transfer the top aqueous phase to a new 15 mL centrifuge tube with a wide-bore pipette tip. A second chloroform:octanol extraction may be performed if the aqueous phase is cloudy due to the presence of PVP.

    • Add 0.5 volume of 5M NaCl to the aqueous solution recovered from the previous step and mix well.

    • Add two volumes of cold (-20°C) 95% ethanol and refrigerate (4 to 6°C) for 15-20 minutes or until DNA strands begin to appear. The solution can be left for one hour or more if necessary.

    • Spin at 3000 rpm for three minutes and then increase speed to 5000 rpm for an additional three minutes at room temperature. This differential spinning step helps to keep DNA at the bottom of the centrifuge tube.

    • Pour off supernatant and wash pellet with cold (0 to 4°C) 76% ethanol. Completely remove ethanol without drying the DNA pellet by leaving the tubes uncovered at 37°C for 20 to 30 minutes.

    • Dissolve in 200 to 300 L TE.

    • Treat with 1 L RNAase A per 100 L DNA solution and incubate at 37°C for 15 minutes.

    • Quantify DNA in a spectrophotometer at A 260.

    • Keep DNA at -70 C for long term and -20°C for short term storage.

    We have obtained higher yields of clean DNA from grapevine leaves by using the modified DNA extraction procedure outlined above. The procedure used for DNA extraction is CTAB-based and is modified from Doyle and Doyle (1990). NaCl has been used to remove polysaccharides (Fang et al., 1992), and PVP to purge polyphenols (Maliyakal, 1992). This procedure does not involve CsCl density gradient purification steps.

    DNA yields from Vitis species, Ampelopsis and other woody perennial plant species by the above mentioned procedure range from 0.5 to 1.0 mg/g fresh leaf tissues with A 260 /A 280 between 1.8 and 2.0 (Table 1). The procedure is fast and simple and 30 to 40 DNA samples may be processed in a single day. Results of DNA restriction digestion with three endonucleases ( Eco RI, Eco RV and Hin dIII) showed complete digestion (Fig. 1a). It is also evident that the uncut DNA exhibits little shearing and is suitable for Southern (1975) hybridization (Fig. 1b). The DNA is also amplifiable in PCR using the RAPD technique (Williams et al., 1990) (Fig. 2).

    Proper choice of the leaf tissue is very important for DNA extraction. The use of very young leaf tissues has resulted in poor yields. We found that partially expanded leaves are the best material. This is consistent with the results reported by Mauro et al. (1992), in which the best results were obtained from rapidly expanding leaves, one to two nodes from the shoot tip. With fully expanded leaves the yield was low and the DNA was not completely digestible. However, we were able to get equally good results with fully expanded leaves when PVP was added to the extraction buffer. PVP has been used to remove polyphenols from mature, damaged and improperly stored leaf tissues (Rogers and Bendich, 1985 Doyle and Doyle, 1987, Howland et al., 1991). PVP forms complex hydrogen bonds with polyphenolic compounds which can be separated from DNA by centrifugation (Maliyakal, 1992). The presence of polyphenolic compounds can be reduced by keeping plant material frozen before extraction and by using PVP in the DNA extraction procedure. The developmental stage of the plant is also important. The optimal time for leaf collection was during the period of active shoot elongation following bud break. Later in the season DNA extraction was difficult and the DNA obtained was unstable for long term storage.

    Complete digestion with restriction endonucleases and amplification in PCR indicate the absence of polysaccharides. Polysaccharides are difficult to separate from DNA (Murray and Thompson, 1980). These compounds are easily identifiable in the DNA preparations as they impart a sticky, viscous consistency to the DNA preparations dissolved in TE buffer. Polysaccharides interfere with several biological enzymes such as polymerases, ligases and restriction endonucleases (Shioda et al., 1987 Richards, 1988). We found that when polysaccharides were not removed the DNA would not amplify. PCR amplification of the DNA with several ten base long oligonucleotides and complete DNA restriction results are consistent with these results. DNA amplification was possible due to the absence of contaminants (Webb and Knapp, 1990 Fang et al., 1992). Fang et al. (1992) found that 1 M NaCl facilitated the removal of polysaccharides by increasing their solubility in ethanol so that they did not co-precipitate with the DNA. However, we found higher concentrations of NaCl (more than 2.5 M) were more effective with the species under study.

    The simplicity of the procedure makes it very practical for DNA extraction especially from Vitis species, hybrids and Ampelopsis and generally from other plant species such as apple, apricot, peach, plum and raspberry. Moreover, DNA yield is higher compared with other procedures used for DNA extraction from grapevines (Bourquin et al., 1991, 5-20 g nuclear DNA /g FW Collins and Symons, 1992, 10-30 g DNA/g FW and Thomas et al., 1993, 25-150 g DNA/g FW). Doyle and Doyle (1987) reported DNA yields up to 1 mg/g of fresh leaf tissues from different plant species and this procedure was used by Mauro et al. (1992) for extraction of grapevine DNA. We have not been able to obtain such a high yield when this procedure was used on grapevine (data not shown). However, we found that DNA extracted by that procedure was occasionally brownish in color and difficult to digest with restriction endonucleases. Such samples also were found to have a shorter storage life. Likewise, the procedure of Doyle and Doyle (1987) gave similar results for different Vaccinium sp. (Rowland and Nguyen, 1993). Our modification of Doyle and Doyle (1990) consistently produces high quality DNA which remains usable for at least two years when stored at -20°C.

    Acknowledgments: We are thankful to Dr. Philip L. Forsline, USDA, ARS, National Clonal Germplasm Repository, Geneva, New York for providing us with Vitis species plant material, Dr. Robert L. Andersen for cherry, apricot, plum and peach, and Mr. Kevin E. Maloney for raspberry. We wish to thank Drs. John C. Sanford and Susan K. Brown for their critical review and valuable suggestions.

    Arumuganathan, K. and E.D. Earle. 1991. Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Mol. Biol. Rep. 9:208-218.

    Baribault, T.J., K.G.M. Skene and N.S. Scott. 1989. Genetic transformation of grapevine cells. Plant Cell Rep. 8:137-140.

    Baribault, T.J., K.G.M. Skene, P.A. Cain and N.S. Scott. 1990. Transgenic grapevines: Regeneration of shoots expressing ß-glucuronidase. J. Exp. Bot. 41:1045-1049.

    Bourquin, J.-C., L. Otten and B. Walter. 1991. Identification of grapevine root-stocks by RFLP. C.R. Acad. Sci. Paris 312 Série III:593-598.

    Collins, G.G. and R.H. Symons. 1992. Extraction of nuclear DNA from grape vine leaves by a modified procedure. Plant Mol. Biol. Rept. 10:233-235.

    Couch, J.A. and P.J. Fritz. 1990. Isolation of DNA from plants high in polyphenolics. Plant Mol. Biol. Rep. 8:8-12.

    Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissues. Phytochem Bull. 19:11-15.

    Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15.

    Fang, G., S. Hammar and R. Rebecca. 1992. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. BioTechniques 13:52-56.

    Hain, R., H.J. Reif, E. Krause, R. Langebartels, H. Kindl, B. Vornam, W. Wiese, E. Schmelzer, P.H. Schreier, R.H. Stöcker and K. Stenzel. 1993. Disease resistance results from foreign phytoalexin expression in a novel plant. Nature 361:153-156.

    Hébert, D., J.R. Kikkert, F.D. Smith and B.I. Reisch. 1993. Optimization of biolistic transformation of embryogenic grape cell suspensions. Plant Cell Rep. (In Press).

    Howland, D.E., R.P. Oliver and A.J. Davy. 1991. A method of extraction of DNA from birch. Plant Mol. Biol. Rep. 9:340-344.

    Katterman, F.R.H. and V.I. Shattuck. 1983. An effective method of DNA isolation from the mature leaves of Gossypium species that contain large amounts of phenolic terpenoids and tannins. Preparative Biochemistry 13:347-359.

    Lodhi, M.A., B.I. Reisch and N.F. Weeden. 1992a. Molecular genetic mapping and genome size of Vitis. Plant Genome-I, 9-11 November, San Diego, CA. (Abstract).

    Lodhi, M.A., B.I. Reisch and N.F. Weeden. 1992b. Molecular genetic mapping of the Vitis genome. Sou. J. Enol. Vitic. 43:393 (Abstract).

    Lodhi, M.A., B.I. Reisch and N.F. Weeden. 1993. Molecular genetic mapping and genome size of Vitis . 90th Meeting Am. Soc. Hort. Sci., July 24-29 (1993), Nashville, TN. (Abstract) HortScience (in press).

    Maliyakal, E.J. 1992. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. Nucleic Acids Res. 20:2381.

    Mauro, M.-C., M. Strefeler, N.F. Weeden and B.I. Reisch. 1992. Genetic analysis of restriction fragment length polymorphisms in Vitis . J. Hered. 83:18-21.

    Murray, M.G. and W.F. Thompson. 1980. Rapid isolation of high molecular weight DNA. Nucleic Acids Res. 8:4321-4325.

    Richards, E. 1988. Preparation of genomic DNA from plant tissue. In: Current Protocols in Molecular Biology. (eds. F.M. Ausubel, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Struhl), pp. 2.3.2-2.3.3. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York.

    Rogers, S.O. and A.J. Bendich. 1985. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Mol. Biol. 5:69-76.

    Rowland, L.J. and B. Nguyen. 1993. Use of polyethylene glycol for purification of DNA from leaf tissue of woody plants. BioTechniques 14: 734-736.

    Shioda, M. and K. Marakami-Muofushi. 1987. Selective inhibition of DNA polymerase by a polysaccharide purified from slime of Physarum polycephalum . Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:61-66.

    Striem, M.J., P. Spiegel-Roy, G.Ben-Hayyim, J. Beckmann and D. Gidoni. 1990. Genomic fingerprinting of Vitis vinifera by the use of multi-loci probes. Vitis 29:223-227.

    Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.

    Thomas, M.R., S. Matsumoto, P. Cain and N.S. Scott. 1993. Repetitive DNA of grapevine: classes present and sequences suitable for cultivar identification. Theor. Appl. Genet. 86:173-180.

    Webb, D.M. and S.J. Knapp. 1990. DNA extraction from a previously recalcitrant plant genus. Plant Mol. Biol. Rep. 8:180-185.

    Weeden, N.F., G.M. Timmerman, M. Hemmat, B.E. Kneen and M.A. Lodhi. 1992. Inheritance and reliability of RAPD markers. In: Proc. Joint Plant Breeding Symposium Series. Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. Crop Science Society of America, American Society for Horticultural Science and American Genetic Association. pp. 12-17.

    Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski and S.V. Tingey. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18:6531-6535.

    Yamamoto, N., G. Ono, K. Takashima and A. Totsuka. 1991. Restriction fragment length polymorphisms of grapevine DNA with phenylalanine ammonia-lyase cDNA. Jap. J. Breed. 41:365-368.

    Table I. Sources and DNA yield of the plant material used for DNA extraction.

    Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon

    Ampelopsis brevipedunculata

    Apple ( Malus domestica cv. Red Delicious)

    Apricot ( Prunus armeniaca cv. NY 500)

    Cherry ( Prunus avium cv. NY 6476)

    Peach ( Prunus persica cv. Rutgers Red Leaf)

    Plum ( Prunus domestica cv. NY 65.363.1)

    Raspberry ( Rubus idaeus cv. NY 83)

    uma NYSAES (New York State Agricultural Experiment Station, Geneva, New York)


    Troubleshooting Guide for Genomic DNA Extraction & Purification (NEB #T3010)

    Need some help purifying genomic DNA with the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010)? We&rsquore here to help. Our troubleshooting guide below outlines some of the most common pain points that scientists encounter during gDNA purification. You can also find guidance on choosing appropriate input amounts in our online resource, Choosing Input Amounts for the Monarch Genomic DNA Purification Kit. Still having trouble? Contact our technical support at any time.

    • Thaw cell pellets slowly on ice and flick tube several times to release the pellet from the bottom of the tube. Be sure to use cold PBS for resuspension, and resuspend gently by pipetting up and down 5&ndash10 times until a uniformly turbid cell suspension is obtained and the pellet is completely dissolved.
    • Add Proteinase K and RNase A to sample and mix well before adding the Cell Lysis Buffer, otherwise the high viscosity of the lysate will impede proper mixing of the enzymes.
    • Keep frozen blood samples frozen and add Proteinase K, RNase A and Blood Lysis Buffer directly to the frozen samples. Start lysis right away and let the samples thaw upon lysis incubation.
    • Fresh (unfrozen) whole blood should not be older than a week. Older samples will show a progressive amount of DNA degradation and loss of yield.
    • Digestion of whole blood samples from some animal species with high hemoglobin content (e.g. guinea pig) may lead to the accumulation of insoluble hemoglobin complexes that stain and clog the membrane, leading to reduced yield and purity. Reduce Proteinase K lysis time from 5 to 3 minutes to prevent the formation of these precipitates.
    • Cut starting material to the smallest possible pieces or grind with liquid nitrogen. In large tissue pieces, nucleases will destroy the DNA before the Proteinase K can lyse the tissue and release the DNA.
    • Proteinase K digestion of fibrous tissues (e.g. muscle, heart, skin, ear clips), brain tissue and all RNAlater-stabilized tissues leads to the release of small indigestible protein fibers that often gives the lysate a turbid appearance. These fibers will block the binding sites of the silica membrane reducing yield and causing protein contamination. To remove fibers, centrifuge lysate at maximum speed for 3 minutes, as indicated in the protocol. For ear clips and brain tissue, use no more than 12&ndash15 mg input material, otherwise the fiber removal will not be complete.
    • Samples that are stored for long periods of time at room temperature, 4°C or -20°C will show degradation and loss of the gDNA content over time. Flash freeze tissue samples with liquid nitrogen or dry ice and store them at -80°C. Alternatively, use stabilizing reagents to protect the gDNA and enable storage for longer periods of time at 4°C or -20°C.
    • Organ tissues like pancreas, intestine, kidney and liver contain significant amounts of nucleases. They should be treated with extreme care and stored properly to prevent DNA degradation. Keep frozen and on ice during sample preparation. Refer to the protocol for the recommended amount of starting material and Proteinase K to use.
    • Some organ tissues (e.g. spleen, kidney, liver) are extremely rich in genomic DNA. Attempting to process quantities larger than the recommended input amounts will result in the formation of clouds of tangled, long-fragment gDNA that cannot be eluted from the silica membrane. Reduce the amount of input material to get a higher yield.
    • Most samples are digested with 10 µl Proteinase K, but for brain, kidney and ear clips, using 3 µl will provide better yields.
    • Samples that are stored for long periods of time at room temperature, 4°C or -20°C will show degradation and loss of the gDNA content over time. Shock freeze tissue samples with liquid nitrogen or dry ice and store them at -80°C. Alternatively, use stabilizing reagents such as RNAlater to protect the gDNA and enable storage for longer periods of time at 4°C or -20°C.
    • Cut starting material to the smallest possible pieces or grind with liquid nitrogen. In large tissue pieces, nucleases will degrade the DNA before the Proteinase K can lyse the tissue and release the DNA.
    • Organ tissues like pancreas, intestine, kidney and liver have a very high nuclease content. They should be treated with extreme care (see &lsquoSample not stored properly&rsquo section above) to prevent DNA degradation. Keep frozen and on ice during sample preparation.
    • Fresh (unfrozen) whole blood should not be older than a week. Older samples will show a progressive amount of DNA degradation and loss of yield.
    • Thawing frozen blood samples releases DNase, causing degradation. Keep frozen blood samples frozen and add enzymes and lysis buffer directly to the frozen samples. Start lysis right away and let the samples thaw upon lysis incubation.

    Guanidine salt was carried over into the eluate:

    The binding buffer contains guanidine thiocyanate (GTC), which shows a very strong absorbance at 220&ndash230 nm.

    The most common way that salt is introduced into the eluate is by allowing the buffer/lysate mixture to contact the upper column area.

      When transferring the lysate/binding buffer mix, avoid touching the upper column area with the pipet tip always pipet carefully onto the silica membrane.


    Assista o vídeo: Peletizadoras do Brasil - Montagem #peletizadora #pelotizadora (Dezembro 2022).