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Quanto maior magnitude implica maior frequência de potencial de ação?

Quanto maior magnitude implica maior frequência de potencial de ação?


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Quanto maior a magnitude do potencial do receptor, maior é a taxa de descarga dos potenciais de ação na fibra nervosa.

Agora considere um caso onde o estímulo (força) é grande, então há mais acúmulo de cargas positivas perto da região geradora de pico, isso formaria o potencial de ação, este potencial de ação deve viajar em ambas as direções, assim como no segmento inicial, onde SD O pico limpa os EPSPs existentes, portanto, se eu aplicar a mesma lógica aqui, o potencial de ação antidrômico deve limpar esses potenciais geradores. Se eu estiver certo, como mais estímulos estão causando potenciais de ação mais frequentes?

Caso 2: Se considerarmos o cenário onde não há condução antidrômica do potencial de ação (por algumas razões desconhecidas), então mais e mais potenciais geradores estão chegando na região geradora de pico (1º nó de ranvier), então também como isso está causando potencial de ação mais frequente geração, se considerarmos que o período refratário do fato é constante para todos os potenciais de ação (em um determinado neurônio)?


Existem vários pontos importantes para responder à sua pergunta, cada um um tanto independente dos outros. Primeiro, vamos pensar sobre este problema da perspectiva de a colina do axônio, onde se pensa que os potenciais de ação são gerados.

A condução de potenciais de ação requer canais de sódio dependentes de voltagem

Quando você fala sobre potenciais de ação antidrômica, você quer dizer quando eles começam no "final" de um axônio e retornam em direção ao corpo celular. Você também pode obter potenciais de ação retropropagando no corpo celular e nos dendritos, mas eles são prejudicados por duas coisas: 1) menos canais de sódio dependentes de voltagem, então o potencial de ação é mais fraco ou não é realmente um potencial de ação, e 2) impedância incompatibilidade. O axônio é muito estreito; o soma é muito grande em comparação (este é um fator menor no contexto dos receptores sensoriais periféricos, onde o soma está localizado longe do local de iniciação do potencial de ação, mas ainda é verdadeiro para os neuritos ali). Alguns íons de sódio entrando em torno do outeirinho do axônio são suficientes para despolarizar essa membrana o suficiente para iniciar um potencial de ação, mas quando esses íons se difundem passivamente para o resto do soma, eles têm muito mais área de membrana para cobrir e não o fazem. t causar tanta despolarização.

O que tudo isso significa é que a "força" de um potencial de ação retropropagante não é menor do que a de um potencial de ação no axônio.

Frequência é relativa

Quando as pessoas falam sobre codificação de frequência de intensidade, elas estão falando sobre um aumento gradual na frequência, não indo imediatamente para o período refratário. Por exemplo, uma célula pode disparar a 1 Hz, a seguir disparar a 4 Hz, a seguir disparar a 16 Hz e, a seguir, disparar a 64 Hz. Se a célula tem um período refratário de 5 ms, mesmo em 64 Hz, não está nem perto de sua taxa de disparo máxima teórica.

Relacionado a esse ponto ... mover íons leva tempo e as células não são isopotenciais

O limiar não é alcançado imediatamente no outeirinho do axônio quando um "período refratário" termina: essa é a diferença entre um período refratário absoluto e um relativo. As concentrações de íons e permeabilidades de íons definem um potencial de equilíbrio, mas, leva tempo para o potencial realmente atingir esse equilíbrio, e tanto a tensão atual quanto o potencial de equilíbrio podem ser diferentes em diferentes partes da célula: isso leva ao fluxo de corrente, o que leva Tempo.

Após um potencial de ação, o outeirinho do axônio tipicamente hiperpolariza por um tempo, às vezes seguido por uma breve despolarização. Durante esse tempo, se houver outras partes da célula (como os dendritos) que ainda estão relativamente despolarizadas de um potencial receptor, os íons estarão fluindo dessas áreas para o outeirinho do axônio. Isso despolariza o outeirinho do axônio, mas, novamente, isso leva tempo (estou repetindo isso propositalmente para transmitir a sensação de que tudo isso é um processo dinâmico e móvel, com íons se movendo em cada etapa). A quantidade de tempo que leva vai depender da diferença de voltagem, portanto, uma maior despolarização nos dendritos trará o outeiro axônio de volta ao limiar mais cedo.

Não muitos íons fluem durante um potencial de ação

Este tem sido um tema recorrente aqui, veja esta resposta: Por que é possível calcular o potencial de equilíbrio de um íon usando a equação de Nernst a partir de medições empíricas na célula em repouso?

A mudança no potencial da membrana não é apenas porque os íons fluem: é porque as permeabilidades mudam, criando brevemente um novo potencial de equilíbrio. Se você tem em sua mente grandes quantidades de íons de sódio e potássio fluindo, perturbando completamente o equilíbrio iônico na célula e abafando todas as outras atividades elétricas, você entendeu errado.

Os estímulos costumam ser de longa duração

Especialmente se você estiver falando sobre um estímulo mecânico, a maioria vai durar muito mais tempo do que um pico individual, que tem apenas ~ 1ms de comprimento. Portanto, embora um estímulo transitório posso causar vários potenciais de ação, muitas vezes o que realmente acontece é que esses potenciais de receptor são bastante duradouros. Efetivamente, eles definem um novo "potencial de repouso" para a célula, que está acima do limite de disparo das células.

Resumindo:

Os potenciais do receptor despolarizam a célula, trazendo-os para ou além do limiar de disparo. Um potencial de ação começa no outeiro do axônio e se propaga ao longo do axônio, mas tem apenas um impacto mínimo no resto da célula. É importante ressaltar que o potencial de ação é realmente breve, poucos íons se movem e há fluxo de corrente em ambas as direções, de modo que as partes despolarizadas da célula ainda estão um tanto despolarizadas, mesmo após um pico. À medida que o segmento axônio inicial se recupera da hiperpolarização do potencial pós-ação e os canais de sódio deixam seu estado inativado, a corrente do potencial do receptor está fluindo para dentro, despolarizando a célula até o limiar e causando outro pico. Repetir.


O papel de BKCa Canais na codificação de sinais elétricos na periferia auditiva de mamíferos

Canais de K + ativados por tensão e Ca 2+ de alta condutância (BKCa) estão envolvidos na formação de padrões de pico em muitos neurônios. Menos se sabe sobre seu papel nas células ciliadas internas de mamíferos (IHCs), células mecanossensoriais com BK invulgarmente grandeCa correntes. Essas correntes podem estar envolvidas na formação do potencial do receptor, sendo de crucial importância para as propriedades dos sinais auditivos aferentes.

Abordamos a função de BKCa registrando respostas induzidas por som de fibras do nervo auditivo aferente (AN) de camundongos com uma deleção direcionada da subunidade & # x003b1 de BK formadora de porosCa (BK & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 ) e comparando-as com as respostas de voltagem de IHCs fixados por corrente. BKCa-correntes mediadas em IHCs foram abolidas seletivamente em BK & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 , enquanto a fisiologia coclear era essencialmente normal no que diz respeito à sensibilidade coclear e ajuste de frequência.

BK & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 As fibras de AN mostraram deterioração da precisão do tempo de pico, medida como uma variação aumentada da latência do primeiro pico em resposta a bursts de tom. Esta deficiência pode ser explicada por uma resposta de voltagem retardada no IHC pré-sináptica resultante da condutância de K + reduzida na ausência de BKCa. As taxas máximas de pico de fibras de AN foram reduzidas quase duas vezes em BK & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 , contrastando com respostas de voltagem aumentadas de IHCs. Além das alterações pré-sinápticas, que podem ser secundárias a uma modesta despolarização de BK & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 IHCs, esta redução nas taxas de AN sugere um papel de BKCa em neurônios pós-sinápticos com AN, que foi sustentado por períodos refratários aumentados.

Em resumo, nossos resultados indicam um papel essencial do IHC BKCa canais para temporização precisa de sinalização coclear de alta frequência, bem como uma função de BKCa no neurônio aferente primário.


MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais O anti-soro específico do fosfosito foi um presente do Dr. Y. Yamagata (Laboratório de Neuroquímica, Okazaki, Japão). Os anticorpos CaMKII foram adquiridos em Life Technologies (Gaithersburg, MD), Santa Cruz Biotechnology (San Diego, CA), Transduction Laboratories (Lexington, KY) e Zymed (San Francisco, CA). O substrato de Ig anti-coelho e anti-rato conjugado com peroxidase de rábano, ECL e ECL Plus foram obtidos de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Ig anti-cabra era da Santa Cruz Biotechnology. O meio essencial mínimo especial (Eagle) com sais de Earle usado para a cultura de neurônios e papel de fosfocelulose foram obtidos da Life Technologies. [& # x003b3- 32 ATP] (3000 Ci / mmol) foi adquirido da DuPont-New England Nuclear (Boston, MA). A membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Immobilon-P) foi adquirida na Millipore (Bedford, MA). ImageQuant e o sistema de análise de imagem Storm são da Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA). Autocamtide-2, sintídeo-2, peptídeos relacionados com autocamtide-2, PKI 6 & # x0201322 amida e PKC19 & # x0201336 foram adquiridos de Bachem (Torrance, CA). O coquetel de inibidores de protease (Completo) era da Boehringer Mannheim, e indo-1 / AM, flu-3 e mag-indo-1 foram adquiridos da Molecular Probes (Eugene, OR). Todos os outros produtos químicos eram de grau analítico e foram adquiridos na Sigma (St. Louis, MO).

Cultura de células. As câmaras multicompartimentais foram feitas de Teflon e fixadas a placas de cultura de 35 mm revestidas com colágeno, conforme descrito (Fields et al., 1992). Neurônios DRG, dissociados de fetos de camundongo de 13,5 d, foram semeados a uma densidade de 0,5 & # x000d7 10 6 células em cada compartimento lateral em um meio de cultura contendo 5% de soro de cavalo e 50 ng / ml de fator de crescimento de nervo conforme descrito anteriormente (Sheng et al., 1993). As células não neuronais foram impedidas de se multiplicar pela adição de 13 & # x003bcg / ml fluoro-2-desoxiuridina 1 & # x020132 d após a semeadura. As culturas foram usadas para experimentos 3 e # x020134 semanas após o plaqueamento para dar tempo para a maioria dos neurônios DRG nos compartimentos laterais para estender os axônios sob a barreira entre os compartimentos lateral e central.

Estimulação elétrica de neurônios DRG. Os axônios que atravessam sob a barreira que separa os dois compartimentos laterais do compartimento central da inserção multicompartimento foram estimulados através de eletrodos de platina em contato com o meio de cultura em lados opostos da barreira. Parâmetros de estimulação e respostas eletrofisiológicas à estimulação foram relatados anteriormente para neurônios DRG nessas câmaras multicompartimentais (Fields et al., 1992). Os neurônios DRG nesta preparação respondem com um único potencial de ação à estimulação com pulso bifásico 1 & # x020135 V, 200 & # x003bcsec. Eles seguem a estimulação de forma confiável e indefinida a taxas de até 3 Hz e por várias dezenas de segundos a 30 Hz (Fields et al., 1990, 1992).

Caracterização de isoenzimas CaMKII. As isozimas CaMKII foram caracterizadas por 8% SDS-PAGE de DRG e lisados ​​cerebrais em tampão de amostra (125 mm Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 10% & # x003b2-mercaptoetanol, 20% glicerol e 0,04% de azul de bromfenol) e imunotransferência. As membranas de PVDF foram bloqueadas em 5% de leite em TTBS (10 mm Tris-HCl, pH 7,5, 150 mm NaCl e 0,1% Tween 20) por 2 horas, lavadas e incubadas em um coletor (Deca-Probe Hoefer) com policlonal anticorpos contra CaMKII - & # x003b1, - & # x003b2, - & # x003b3 e - & # x003b4 (Santa Cruz Biotechnology), anticorpos monoclonais Cb & # x003b1-2 (Life Technologies) e CB & # x003b1-2 (Zymed) a 1: 1000 durante 2 horas à temperatura ambiente. As membranas lavadas foram então feitas reagir com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano silvestre durante 1 hora à temperatura ambiente e detectados por ECL.

Autofosforilação de CaMKII em Thr-286. A autofosforilação de CaMKII em Thr-286 foi analisada por imunotransferência usando um anticorpo específico de fosfosito que reconhece CaMKII apenas quando é autofosforilado em Thr-286 (& # x003b1) ou Thr-287 (& # x003b2, & # x003b3, & # x003b4) (Yamagata e Obata, 1998). Os neurônios foram lavados três vezes e mudados para solução salina fisiológica contendo 50 nm de Ca 2+ livre (Scholz e Palfrey, 1998). Este foi obtido substituindo (em m m): 0,74 CaCl2, 1,13 MgCl2e 2 EGTA na solução PBS padrão (PSS). Após 1 hora de equilíbrio, a concentração de cálcio foi aumentada para 1,2 m m de Ca 2+ livre por 5 & # x0201345 seg por adição de 100 m m de CaCl2 para a mesma solução. Os neurônios tratados foram lisados ​​em tampão de amostra em ebulição para eletroforese e análise de imunotransferência.

Para a quantificação da autofosforilação de Thr-286, igual volume de lisados ​​de controle e neurônios tratados foram resolvidos em paralelo por SDS-PAGE em géis duplicados de 10% e eletrotransferidos para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas em 5% de leite em TTBS por 2 horas à temperatura ambiente, lavadas e incubadas em anticorpo que reconheceu CaMKII total em 1: 1500 (anticorpo monoclonal clone 38 Transduction Laboratories) ou anticorpo específico de fosfosito (1: 10.000) durante a noite em 4 e # x000b0C. As membranas incubadas foram lavadas e feitas reagir em anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre por 1 hora em temperatura ambiente. Os imunocomplexos foram visualizados com substrato ECL Plus e quantificados com ImageQuant e sistema de análise de imagem Storm. A linearidade da medição de imunorreatividade foi testada carregando diferentes volumes de lisado de neurônios DRG cultivados em câmaras. A imunorreatividade relativa (RFU) contra a enzima autofosforilada e total estava dentro da faixa dinâmica. De acordo com o fabricante do Storm (nota de aplicação # 60), a faixa dinâmica de medição é 0 & # x020133 & # x000d7 10 7 RFU, enquanto as leituras neste estudo variaram entre 0,2 e 1 & # x000d7 10 6 RFU. A autofosforilação relativa em Thr-286 foi comparada por normalização do RFU obtido com a enzima fosforilada com a da enzima total na mesma amostra de experimentos paralelos.

Para determinar o [Ca 2+] necessário para ativar autonomamente o CaMKII em vitro, O sobrenadante DRG de neurônios não estimulados foi autofosforilado usando uma adaptação do método de Molloy e Kennedy (1991). Resumidamente, tubos de ensaio contendo diferentes concentrações de Ca 2+ (0,1 & # x020131000 & # x003bc m) e 6 & # x003bc m CaM foram fosforilados por 15 ou 45 segundos com 1 m m de MgCl2 e 0,02 m m ATP. Após autofosforilação, autocamtide-2 mais EGTA (2 m final) foi adicionado a cada tubo, e a incubação continuou por 5 min. A atividade independente e dependente de Ca 2+ também foi determinada em paralelo em sobrenadantes que não foram autofosforilados em vitro.

Ensaio de atividade CaMKII.A atividade dependente e independente de Ca 2+ & # x02013 de CaMKII foi medida em homogenatos neuronais por fosforilação de autocamtide-2 (KKALRRQETVDAL), um peptídeo derivado do local de autofosforilação de CaMKII. O ensaio da quinase foi linear em relação ao tempo e à quantidade de lisado usado para análise. Neurônios equilibrados em 1,2 m m Ca 2+ -PSS por 1 hora foram eletricamente estimulados a 0,1, 0,3, 0,5, 1 e 10 Hz, fornecendo 45 pulsos nessas frequências por durações de até 10 min. No final da estimulação, os neurônios foram colhidos em 0,20 ml de tampão de lise gelado (50 mm HEPES, pH 7,5, 1 mm EDTA, 5 mm EGTA, 2 mm DTT, 0,1% TX-100, 100 mm & # x003b2- fosfato de glicerol, pirofosfato de sódio 10 mm, NaF 50 mm, coquetel de inibidor de protease e 1 & # x003bc m Microcisteína LR). Os neurônios coletados foram sonicados em um banho de gelo com um sonicador de sonda Bronson (dois pulsos a 40% do ciclo de trabalho e saída de 2) e centrifugados a 15.000 & # x000d7g, por 15 min a 4 & # x000b0C. Os ensaios de quinase foram realizados em 8,5 & # x003bcl alíquotas do sobrenadante usando 20 & # x003bc m autocamtide-2 na presença de 1 mm Ca 2+ e 6 & # x003bc m CaM (atividade total), e em amostras paralelas a reação foi realizado na ausência de Ca 2+ com 1 mm de EGTA (atividade independente de Ca 2+). A atividade de fundo foi determinada a partir do sobrenadante que reagiu sem o substrato. Os tubos de reação também continham 5 & # x003bcm do inibidor da proteína quinase A PKI 6 & # x0201322 amida e 2 & # x003bcm do inibidor da proteína quinase C (PKC19 & # x0201336). As reações enzimáticas, em um volume final de 50 & # x003bcl, foram iniciadas pela adição de Mg 2+ & # x02013ATP cocktail [5 m m de acetato de magnésio e 0,1 m m de ATP (2000 & # x020133000 cpm / pmol)]. A reação foi interrompida após 5 min com solução saturada de EDTA & # x02013EGTA, e 40 & # x003bcl foi manchado em papel de fosfocelulose. O papel de fosfocelulose foi lavado uma vez em água e três vezes em ácido fosfórico 75 mM. As membranas foram secas ao ar e usadas para medição de radioatividade por contagem de cintilação líquida. Para cada amostra, as contagens de fósforo radioativo de tubos de ensaio em que a mistura de reação continha lisado celular na presença de 1 mm de EGTA e nenhum Ca 2+ foram comparadas com contagens de tubos em que uma quantidade igual do lisado celular reagiu no presença de 1 mm Ca 2+ e 6 & # x003bc m CaM. A atividade autônoma de CaMKII nesses lisados ​​celulares foi determinada pela razão das atividades independentes de cálcio e dependentes de cálcio.

Medições de cálcio intracelular. Os transientes de cálcio evocados eletricamente ou quimicamente em neurônios DRG foram medidos usando um microscópio confocal Bio-Rad (Hercules, CA) 1024 visível / UV e uma objetiva de imersão em óleo de abertura numérica Nikon 40 & # x000d7 1.3 em um microscópio invertido Nikon. As medições quantitativas de cálcio foram feitas usando medições raciométricas de intensidade de fluorescência em emissão de 460 e 405 nm de neurônios DRG carregados por incubação em 7,5 & # x003bc m indo-1 / AM ou magn indo-1 / AM e excitado por um laser de argônio & # x02013ion em 350 nm (Fields e O'Donovan, 1997). As medições foram realizadas à temperatura ambiente em solução salina balanceada tamponada com HEPES, pH 7,2. Calibração na célula, conforme descrito em Fields et al. (1993), foi usado para fornecer uma estimativa do [Ca 2+]eu associados com as razões de fluorescência. Brevemente,Rmin eRmax foram determinados em neurônios permeabilizados por 10 & # x003bc m ionomicina, em soluções contendo 1,8 m m Ca 2+ e 0 m m Ca 2+ / 10 m m EGTA, sob os mesmos ganhos intensificadores e ajustes de pinhole que foram usados ​​durante os experimentos. Medições de [Ca 2+]eu foram feitas dentro de um plano óptico que passa pelo centro do núcleo na área do citoplasma a meio caminho entre a membrana celular e o núcleo. A área de medição compreendeu & # x0223c1 / 8 da área do citoplasma no plano da seção. As respostas medidas foram uniformes em diferentes regiões da célula na escala de tempo relatada nesses experimentos.Um dispositivo de perfusão controlado por válvula eletromagnética (Warner Instruments, Hamlin, CT) foi usado para alterar rapidamente a concentração de cálcio extracelular na solução de banho.

Microscopia confocal de varredura de linha única foi usada para aquisição de alta velocidade de mudanças em [Ca 2+]eu em resposta a potenciais de ação de 0,1 & # x0201330 Hz usando o indicador de cálcio raciométrico indo-1 e o indicador de intensidade fluorescente fluo-3. Os dados foram adquiridos a uma taxa de 8 mseg / linha de varredura por 2 segundos (250 linhas de varredura) para indicadores raciométricos e não ratiométricos. Em neurônios individuais, as medições quantitativas foram feitas em quatro pontos ao longo de uma linha que divide o neurônio dentro de uma seção óptica que passa pelo centro do núcleo: (1) na região da submembrana, (2) no citoplasma a meio caminho entre a membrana e o núcleo , (3) no centro do núcleo, e (4) no ponto médio do citoplasma no lado oposto do núcleo.


Introdução

Em axônios, a condução supernormal e subnormal ocorre quando a velocidade de propagação do potencial de ação (AP) é aumentada ou diminuída em relação a um AP inicial em membrana previamente inativa (Bucher e Goaillard 2011). A condução supernormal e subnormal pode alterar o tempo de pico, o que pode afetar as estratégias de codificação temporal nas quais as informações são armazenadas em frequências e atrasos instantâneos (Dayan e Abbot 2001). A condução supernormal comumente ocorre para APs de baixa frequência entre 50 e 150 Hz e é causada pela descarga da capacitância da membrana que pode ser alterada por canais iônicos (Barrett e Barrett 1982 Bostock et al. 2003 Bucher e Goaillard 2011). A condução subnormal geralmente ocorre durante surtos de PAs de alta frequência, pois o período refratário relativo do PA precedente diminui o número de canais de sódio ativos disponíveis para o PA subsequente e pode comprometer a transmissão por neurônios de disparo de alta frequência.

Os neurônios de disparo de alta frequência estão envolvidos em muitos circuitos do sistema nervoso dos mamíferos. Interneurônios corticais de pico rápido, neurônios de retransmissão talâmica e células espessa globulares são todos capazes de seguir frequências & gt100 Hz (Steriade et al. 1993 Rudy et al. 1999 Rhode 2008). Os mecanismos para a produção de APs de alta frequência foram bem estudados e incluem Kv3 correntes de potássio, que fornecem repolarização rápida de APs (Rudy e McBain 2001), e correntes de cálcio do tipo T, que fornecem uma despolarização prolongada para estouro de alta frequência (Cain e Snutch 2013). No entanto, a transmissão de APs de alta frequência por axônios é mal compreendida devido aos seus pequenos diâmetros, tornando-os inacessíveis ao estudo direto. Em vez disso, axônios gigantes de invertebrados e modelagem computacional têm sido usados ​​principalmente para explorar a dinâmica dos axônios (Debanne 2004). Além disso, pouco se sabe sobre os mecanismos axonais que neutralizam ou aumentam a condução supernormal ou subnormal.

O neurônio detector de movimento contralateral descendente (DCMD) no gafanhoto fornece um axônio modelo para estudos de transmissão de alta frequência. É um axônio gigante que retransmite informações visuais em altas velocidades do neurônio detector de movimento gigante da lóbula (LGMD) no cérebro para os neurônios nos gânglios torácicos (O'Shea et al. 1974). Sua resposta a um estímulo visual iminente foi bem caracterizada e está envolvida com a evasão de predadores (Gabbiani et al. 1999, 2001, 2002 Gray et al. 2001 Fotowat e Gabbiani 2007 Fotowat et al. 2011). Ele transmite APs de alta frequência aos motoneurônios de maneira confiável para desencadear o comportamento de escape (Santer et al. 2006 Fotowat et al. 2011) e em temperaturas normais de operação é capaz de frequências & gt500 Hz (Money et al. 2005).

No DCMD, temperaturas elevadas aumentam a frequência máxima de disparo e produzem um potencial de pós-despolarização (ADP) que é modulado pela temperatura e um choque térmico de pré-condicionamento (Money et al. 2005) (Fig. 1C). Ao despolarizar temporariamente o potencial de membrana acima de seu valor de repouso, acredita-se que o ADP melhora a excitabilidade no axônio DCMD (Money et al. 2005) e ADPs semelhantes estão presentes em axônios de rato e sapo, onde contribuem para a condução supernormal (Bowe et al. 1987). Várias correntes podem produzir ADPs semelhantes, incluindo correntes de cálcio do tipo T, correntes de sódio persistentes e ressurgentes e corrente de cálcio não seletiva ativada por cálcio (Bean 2007).

Nós investigamos os mecanismos que permitem a condução de alta frequência no axônio DCMD. Começamos pela hipótese de que uma corrente de cálcio do tipo T está subjacente ao ADP gerado no axônio para permitir a condução de alta frequência. Para testar isso, expusemos o axônio DCMD a cátions divalentes, cádmio e níquel, antagonistas das correntes de cálcio do tipo T. Os cátions divalentes reduziram significativamente a velocidade de condução (CV), particularmente em altas frequências no axônio DCMD, e aumentaram a magnitude da pós-hiperpolarização (AHP). A remoção do cálcio extracelular não mimetizou os efeitos dos cátions divalentes no CV, sugerindo que os efeitos do canal de cátions divalentes não foram mediados por uma corrente de cálcio do tipo T. Os modelos computacionais confirmam que as correntes que encurtam a magnitude e a duração do AHP, como as correntes de sódio persistentes e ressurgentes, podem melhorar a condução de alta frequência pelo axônio.


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- Se houver um estímulo, ele abre o canal fechado que pode causar uma mudança na permeabilidade do íon da membrana e, por extensão, uma mudança no potencial de membrana do neurônio. Isso leva a um AP.

  • DIFERENTES TIPOS DE CANAIS GATED o Voltage-gated:  Voltagem (estímulo) abre as portas.  Inicialmente, é fechado onde é negativo na face interna da membrana e positivo na face externa (uma condição típica de repouso).  Uma mudança no MP (abre as portas), faz com que o interior seja menos negativo e o exterior menos positivo.  Dependendo de qual íon o canal é permeável, os íons vão começar a se mover através da membrana celular e mudar o MP. o Ligado-gated  Um ligante é uma pequena molécula que se liga a um canal de proteína maior.  Eles são fechados sempre que o ligante é desvinculado e abertos sempre que o ligante é ligado.  Isso permite que os neurônios sejam capazes de responder a estímulos químicos, como moléculas gustativas, odorantes, neurotransmissores, etc.
  • por exemplo, os neurotransmissores podem servir como ligantes extracelulares, induzindo alterações no potencial de membrana em neurônios pós-sinápticos.  Existem dois tipos: intracelular e extracelular. o Fechado mecanicamente  Aberto em resposta a estímulos mecânicos, como pressão, toque, alongamento, etc.

o Temperatura bloqueada.  Eles permitem que a temperatura seja um estímulo ao qual um neurônio poderia responder.  Eles geralmente têm uma região chamada região metaestável, que é muito provável que se desenvolva em resposta a apenas uma pequena mudança na temperatura.  Quando a temperatura muda, essa região passa de bem dobrada (os portões do canal fechados) a perdendo sua estrutura (os portões do canal abertos).  Nesse caso, as células estão aproveitando a desnaturação ao desencadear um AP. Outra maneira pela qual podemos eliciar potenciais de ação dentro dos neurônios é usando um estimulador.

Como o estimulador faz com que ocorra um potencial de ação?

  • O AP gerado pelo estimulador é diferente do AP gerado in vivo.
  • Isso é conhecido como estímulo despolarizante de limiar porque está fazendo com que o potencial de membrana chegue ao valor de limiar. Assim, um potencial de ação foi eliciado e ocorreu em resposta.
  • Mesmo se houver um estímulo excitatório, ele pode não eliciar um potencial de ação. Portanto, deve ser forte o suficiente para chegar ao limiar ou um somatório de múltiplos potenciais excitatórios.

Os potenciais graduados são proporcionais em sua magnitude à força do estímulo que os eliciou (ou seja, correspondência perfeita entre a força de um estímulo e a magnitude do grande potencial que ele irá produzir).

  • Estímulos de hiperpolarização hiperpolarizam a membrana - abrindo canais de potássio e cloreto. o Tanto o potássio quanto o cloreto têm um potencial de equilíbrio que geralmente é mais negativo do que o repouso. o Portanto, a abertura dos canais bloqueados de potássio ou cloreto permite que o potencial de membrana se mova para o O potássio deixa a célula e o torna mais negativo no interior. o O cloreto entra e o torna mais negativo por dentro. o A abertura de canais bloqueados de potássio ou cloreto faz com que o potencial de membrana se mova para mais perto do
  • Para os estímulos despolarizantes - abertura de um canal de sódio - O potencial de equilíbrio para o sódio é geralmente um número muito positivo. o Assim, permitir a entrada de sódio faz com que o potencial de membrana dessa célula se aproxime do

O estímulo ao qual o íon é submetido in vivo, ou causa a abertura de um canal de potássio ou cloreto, dando-nos uma hipopolarização em resposta e potencial inibitório, ou teria causado a abertura de canais de sódio, dando-nos uma resposta excitatória em vez de.

Potenciais de ação são eventos tudo ou um.

A figura começa com a aplicação de um estímulo de limiar. O estímulo de limiar trouxe o potencial de membrana ao limiar. Então, um potencial de ação ocorreu em resposta. Em seguida, um estímulo supralimiar é aplicado.

  • O estímulo supralimiar é mais forte do que o estímulo necessário para chegar ao limiar.
  • Independentemente de ser um estímulo supralimiar fraco ou forte, o potencial de ação gerado em resposta é idêntico ao estímulo limite.

Isso nos diz que a força do estímulo não importa, contanto que seja forte o suficiente para chegar ao limite para gerar um PA em resposta. Portanto, é um evento tudo ou nada porque um AP é gerado ou não gerado.

Os potenciais de ação não são como potenciais graduados.

  • A magnitude de um potencial graduado é exatamente paralela à magnitude ou à força do estímulo que foi produzido. Mas esse não é o caso para os potenciais de ação individuais, independentemente da força dos estímulos (é um evento tudo ou nada).

Os canais de sódio e potássio dependentes de voltagem são a chave para os potenciais de ação e sua propagação.

  • Na condição de repouso, o RMP do neurônio é de aproximadamente -70mV. Nesse estado, os canais controlados por voltagem de sódio e potássio estão em sua condição fechada.
  • Quando um estímulo despolarizante é aplicado, ele causa um potencial graduado de despolarização e traz o potencial de membrana até o potencial limite marcado onde ocorrerá um AP. Chegar ao potencial limite é o estímulo que causa a abertura dos canais controlados por voltagem de sódio e potássio.
  • Embora os canais de sódio e os canais de potássio estejam sendo abertos pelo mesmo estímulo, eles não abrem na mesma taxa.
  • Em seguida, os canais de sódio dependentes de voltagem irão se inativar espontaneamente, evitando que os íons de sódio atravessem a membrana. Nesse ponto, os canais de potássio controlados por voltagem estão totalmente abertos. Isso leva à fase de repolarização de um AP.
  • Uma vez que o potencial de membrana volta ao valor do potencial limite, ele serve como o sinal, que fará com que os canais de sódio e potássio bloqueados por voltagem se fechem.
  • Quando os canais de potássio controlados por voltagem se fecham totalmente, o potencial da membrana volta à sua condição de repouso.

- Ao mesmo tempo em que uma porta de ativação está fechando e causando a ativação desses canais de sódio dependentes de voltagem, os canais de potássio dependentes de voltagem se abrem, permitindo que a repolarização ocorra.

Como os canais de sódio controlados por voltagem vão de inativos para fechados?

A única maneira de isso acontecer é o sensor de voltagem se mover de volta para sua posição original voltada para dentro. Quando isso acontecer, vai causar o fechamento do portão de ativação. Quando o portão de ativação fecha, ele empurra com força o portão de inativação para abrir.

  • Portanto, não há como abrir um canal de sódio controlado por voltagem a partir de seu estado inativo.
  • A única maneira de abrir a porta de inativação é o sensor de voltagem reiniciar para fazer com que a porta de ativação feche, o que força a porta de inativação a abrir.
  • Isso nos diz que, depois que um canal de sódio controlado por voltagem se torna inativo, ele não pode passar desse estado para o estado aberto. Tem que ir primeiro para o estado fechado e depois para o estado aberto.

O sensor de tensão não reinicializará a porta de ativação até que a repolarização de volta ao limite ocorra, o que faz com que a porta de inativação seja deslocada.

Os canais controlados por tensão também são a chave para a propagação de AP.

  • Propagação: mover o potencial de ação do outeirinho do axônio (local de geração) para baixo em direção aos terminais do axônio, o que permitirá que o neurônio libere neurotransmissores e se comunique com outro neurônio, músculo ou glândula, etc.
  • Tempo = 0ms o Os canais de sódio controlados por tensão estão abertos o Os íons de sódio entram no citosol e fazem com que o Uma vez que entrem, percebam que existem. Assim, os íons de sódio carregados positivamente serão atraídos para os íons carregados negativamente no o Como resultado, os íons de sódio começam a se espalhar para longe do local onde o potencial de ação ocorreu, atraídos para o Conforme os íons de sódio começam a se difundir na região atraídos por essas cargas negativas, isso vai causar o. na próxima região a jusante serão acionados para abrir
  • Tempo = 3ms o Há um AP ocorrendo a jusante de onde o AP inicial ocorreu. - Os íons de sódio entrarão através dos canais de sódio controlados por voltagem aberta. o Eles vão se difundir lateralmente ao longo do axônio atraídos pelas cargas negativas adjacentes e trazer o
  • Tempo = 7ms o O AP é propagado para baixo por causa da atração do sódio por espécies carregadas negativamente no

Conforme o íon sódio de um AP entra, eles se difundem pelo axônio atraídos para as regiões de repouso carregadas negativamente adjacentes e trazem o potencial de membrana dessas regiões para o valor limite. Assim, gerando um AP. Então, novo sódio entrará e o processo será repetido várias vezes.

Os íons de sódio que se difundem em duas direções:

  • Alguns estão se difundindo downstream e disparando APs.
  • Alguns estão se difundindo para trás onde a região sofreu AP anteriormente. o Por que um potencial de ação também não ocorre na região a montante?

Os canais de sódio controlados por tensão podem ser abertos a partir do estado fechado, mas não do estado inativo.

Os potenciais de ação geralmente são propagados unidirecionalmente (os AP ocorrem a jusante e não a montante).

  • A propagação upstream ocorre em alguns casos.
  • É determinado pela velocidade com que ocorre a repolarização. o Se a repolarização de volta ao limite acontecer muito rapidamente, é possível que a tensão bloqueada o É muito raro, mas acontece quando há canais de potássio de ação muito rápida que se abrem muito rapidamente

Um potencial de ação se propaga sem decréscimo.

  • Um eletrodo estimulante é inserido na região do axônio e submete o neurônio a um estímulo despolarizante.
  • Três eletrodos adicionais foram colocados em vários pontos ao longo do axônio.
  • O primeiro eletrodo de registro está detectando um potencial de ação. Ele também captou o potencial graduado que resultou do estímulo despolarizante.
  • O segundo eletrodo de registro está localizado mais abaixo e está detectando um potencial de ação um pouco mais tempo do que o eletrodo de registro original porque está mais abaixo. Então, vai demorar um pouco mais para o potencial de ação chegar ao segundo eletrodo.
  • O terceiro eletrodo de registro capta o potencial de ação em um momento ainda mais tarde, porque leva tempo para que o potencial de ação viaje até este eletrodo de registro.

Novos potenciais de ação que estão sendo regenerados ao longo do comprimento do axônio são os mesmos. Portanto, não há diminuição da magnitude do potencial de ação à medida que ele se desloca ao longo do comprimento do axônio.

 Durante a primeira metade do período refratário absoluto, ocorre a fase de despolarização do potencial de ação, onde os canais de sódio dependentes de voltagem já estão abertos. Então, um AP já está sendo gerado.  Se os canais já estão abertos, não podem ser abertos novamente (não podemos abrir uma porta que já está aberta).  Na fase de repolarização do período refratário absoluto, os canais de sódio estão em um estado inativo.  Canais de sódio controlados por tensão não podem abrir a partir de seu estado inativo. Eles precisam ser fechados primeiro para serem abertos.  Quando o potencial de membrana volta para o potencial limite, os canais de sódio controlados por voltagem passam de inativos para fechados.  Quando no estado fechado, eles podem ser abertos e gerar outro AP. Nesse momento, o período refratário relativo é atingido.

Período refratário relativo - Durante este tempo específico, outro AP pode ser gerado, mas é relativamente mais difícil de fazer. o Os canais de potássio controlados por voltagem ainda estão abertos. Então, eles estão causando a hipopolarização. o Para gerar outro potencial de ação, o potencial de membrana deve estar de volta ao potencial limite. o Outro PA pode ser gerado se a força do estímulo que vai causar aquele potencial de ação for forte o suficiente para compensar o efeito de hiperpolarização (causado por canais de potássio com voltagem aberta).

Inicialmente, há um estímulo fraco.

É um valor limite porque comprou o potencial de membrana para o limite e um AP ocorre em resposta.

Pouco depois, o neurônio é atingido por um estímulo muito forte. No entanto, como o neurônio ainda está no período refratário absoluto e acima do limiar, a força do estímulo não importa. Portanto, outro AP não pode ser gerado. Portanto, não há mais APs ocorrendo.

Uma vez que o potencial de membrana está abaixo do limiar, o neurônio faz a transição para o período refratário relativo.

Quando abaixo do limite, os canais de potássio controlados por voltagem começam a fechar gradualmente.

O valor do potencial de membrana vai para o estado de hiperpolarização. Como há muitos canais de potássio abertos por voltagem, o potencial de membrana está se movendo em direção ao potencial de equilíbrio muito negativo para o potássio.

Mas o potencial de membrana está lentamente voltando para o valor de repouso, conforme mostrado no gráfico (linha azul).

Quando o neurônio entra pela primeira vez no período refratário relativo, outro PA pode ser gerado, mas a força do estímulo necessária para fazer isso deve ser um estímulo muito forte (por causa dos canais de potássio abertos de voltagem).

Com o tempo, a força do estímulo necessária para obter outro potencial de ação torna-se gradualmente menor devido ao fechamento gradual dos canais de potássio controlados por voltagem. Portanto, há uma diminuição gradual na quantidade de hiper polarização ocorrendo.Como resultado, um forte estímulo não é necessário para se opor a essa hiperpolarização.

A força dos estímulos (barras vermelhas) é ainda maior do que o estímulo inicial (barra azul), o que é consistente com a ideia de que um estímulo mais forte do que o estímulo original é necessário para gerar outro PA no período refratário relativo.

  • Consequência: o A força do estímulo influencia a frequência com que os potenciais de ação são gerados. o Os potenciais de ação são tudo ou nada (ou seja, não importa o quão forte seja o estímulo, a mesma magnitude de AP o Como o neurônio comunica informações sobre a força de um estímulo que eliciou seu PA?

Uma estratégia utilizada para aumentar a velocidade de propagação do potencial de ação é o aumento da energia elétrica

Resistência da membrana plasmática, que ocorre quando uma bainha de mielina isolante é enrolada

A membrana axonal.

Mielina: múltiplas camadas da membrana plasmática de um oligodendrócito ou célula de Schwann envolvida em torno de um axônio.

A mielina é composta por células gliais:

  • Oligodendrócito no sistema nervoso central
  • Células de Schwann no sistema nervoso periférico

A mielina é 80% lipídica e 20% proteica, o que corresponde exatamente à composição típica da membrana plasmática (a membrana é composta principalmente por fosfolipídios com proteínas embutidas). Por causa das camadas que envolvem o axônio, o citoplasma entre as camadas da membrana plasmática é espremido.

  • Condução saltatória (de axônios mielinizados) - Os potenciais de ação estão sendo gerados apenas em locais discretos ao longo do axônio, os nódulos de Ranvier. - Quando o axônio é estimulado, ocorre uma despolarização rápida. - Os íons de sódio começam a viajar para baixo do axônio e ocorre a condução decremental. o Se a condução decremental levar o potencial de membrana abaixo do limite, um novo AP deve ser o Portanto, deve haver outro canal de sódio controlado por voltagem presente em uma posição onde a membrana o Por causa da bainha de mielina, a condução decremental é mais lenta. Assim, o sódio gated voltagem o Assim, não há necessidade de gerar potenciais de ação freqüentes dentro de um axônio mielinizado por causa de como o

Cada vez que um novo AP é gerado, os íons de sódio que chegam ao axônio não percorrem seu comprimento porque leva tempo para repor os íons perdidos por vazamento. Quando os íons estão sendo reabastecidos, o sinal não está sendo propagado pelo axônio.

  • Poucos pontos lentos no processo de propagação = propagação completa realizada mais rapidamente.
  • Embora existam vários íons de sódio entrando, apenas os íons que viajam pelo axônio contribuem para o novo AP e propagam o sinal.

Portanto, a mielina acelera a propagação do potencial de ação, permitindo que menos potenciais de ação ocorram.

A bainha de mielina corrige o vazamento da membrana.

  • A bainha de mielina é composta por camadas de membrana plasmática.
  • Os íons não passam pelas membranas plasmáticas com muita facilidade.
  • Se a condição decremental é causada pelo vazamento de íons do axônio de volta para o fluido extracelular, por ter uma bainha de mielina vai manter os íons dentro do axônio por mais tempo. Isso permite que eles viajem mais longe sem condução decremental.

Pense em cada AP gerado como um influxo de íons que não contribui para a propagação do sinal: eles são os pontos lentos na propagação.


Resultados

Potenciais pós-sinápticos excitatórios unitários foram registrados a partir de neurônios piramidais de camada espessa de tufos 5 em resposta a padrões de disparos de potencial de ação evocados em neurônios piramidais de camada pré-sináptica 2/3 ou neurônios piramidais de camada 5 vizinhos durante o registro simultâneo de grupos de três ou quatro neurônios em ratos neocorticais fatias de cérebro (Fig. 4B ).

EPSPs unitários evocados por trens de pico simples

Primeiro, examinamos as propriedades dependentes do uso dessas classes de sinapse excitatória usando um protocolo de pulso pareado padrão, onde dois potenciais de ação foram evocados em um intervalo de 25 ms com um longo período quiescente entre as apresentações (5 s Fig. 1). Em resposta a este protocolo de estímulo simples, as propriedades dependentes do uso da camada 2/3 à camada 5 e da camada 5 à camada 5 uEPSPs foram consideradas distintas. As conexões da camada 2/3 para a camada 5 exibiram, em média, pouca modificação dependente do uso em resposta à apresentação de dois potenciais de ação (relação de pulso emparelhado, 1,14 & # x000b1 0,03 n = 140 conexões), enquanto as conexões da camada 5 para a camada 5 exibiram uma poderosa facilitação de pulso emparelhado (1,84 & # x000b1 0,11 n = 42 P & # x0003c 0,0001 Fig. 1UMA e B ) Como observações anteriores sugeriram que as propriedades dependentes do uso das entradas sinápticas excitatórias são determinadas pela localização das sinapses dentro da árvore dendrítica dos neurônios piramidais da camada 5 (Williams & # x00026 Stuart, 2002), exploramos a relação entre o tempo de subida e dinâmica de pulso emparelhado de uEPSPs. O tempo de aumento somático da camada 5 para a camada 5 uEPSPs foi significativamente mais rápido do que o tempo de aumento evocado pelos neurônios piramidais da camada 2/3 (camada 5 para a camada 5, 1,8 & # x000b1 0,1 ms n = 42 camada 2/3 a camada 5, 2,3 & # x000b1 0,1 ms n = 140 P & # x0003c 0,0001). Isso sugere que os contatos sinápticos subjacentes da camada 5 à camada 5 uEPSPs são formados em locais dendríticos relativamente proximais (Markram et al. 1997) e que os uEPSPs gerados a partir de loci dendríticos proximais exibem um maior grau de facilitação de pulso pareado (Fig. 1C ) Para examinar se essa relação se manteve para uma via excitatória definida, traçamos a relação entre o tempo de subida e a dinâmica dependente do uso da camada 2/3 para a camada 5 uEPSPs (Fig. 1D ), uma vez que os contatos sinápticos da camada 2/3 à camada 5 demonstraram ser feitos em locais em todo o caramanchão dendrítico apical de grandes neurônios piramidais da camada 5 (Williams & # x00026 Stuart, 2002 Sjostrom & # x00026 Hausser, 2006). Os dados agrupados revelaram que os uEPSPs da camada 2/3 de aumento rápido para a camada 5 exibiram facilitação de pulso pareado, enquanto os uEPSPs de aumento lento mostraram depressão de pulso pareado (r 2 = 0,23 probabilidade não correlacionada, P & # x0003c 0,0001 n = 140 Fig. 1D ) Nesse caminho, portanto, existe uma relação simples entre a localização da sinapse dendrítica e o sinal (facilitação ou depressão) da dinâmica de pulso pareado. Em contraste, não encontramos nenhuma correlação entre a razão de pulso emparelhado e o tempo de subida do uEPSP para a camada 5 para a camada 5 uEPSPs (r 2 = 0.02 n = 42). Verificar a atribuição do sítio dendrítico de geração de uEPSP pelo tempo de subida do uEPSP e excluir o envolvimento de mecanismos dendríticos não lineares na formação das propriedades dinâmicas dependentes da distância de uEPSPs (Banitt et al. 2005), simulamos gEPSPs com propriedades uniformes em locais somatodendríticos definidos usando técnicas de gravação dendrítica e de fixação dinâmica. Os gEPSPs gerados dendriticamente tiveram tempos de aumento somático que abrangeram a faixa observada para uEPSPs (40 & # x02013680 & # x003bcm do soma Fig. 1E , inserção). Em contraste com uEPSPs, a proporção de pulso emparelhado de gEPSPs registrados tanto no local de geração quanto no soma foram próximos a um para eventos gerados ao longo da árvore dendrítica apical (dois gEPSCs gerados em um intervalo de 25 ms Fig. 1E ) Esses dados revelam que as propriedades dinâmicas das sinapses excitatórias dendríticas podem ser registradas do soma sem distorção.

UMA, camada média 2/3 a camada 5 e camada 5 a camada 5 EPSPs unitários (Vpublicar, traços superiores) evocados em resposta a um e dois (25 ms de intervalo) potenciais de ação pré-sináptica (Vpré). Os traços vermelhos são subtrações digitais. B, distribuição das razões de pulsos emparelhados da camada 2/3 para a camada 5 (^ n = 140) e da camada 5 à camada 5 (& # x02022 n = 42) EPSPs unitários - as linhas de queda indicam valores medianos. C, distribuição do tempo de subida somático da camada 2/3 para a camada 5 (^) e da camada 5 para a camada 5 (& # x02022) EPSPs unitários as linhas de queda indicam o maior tempo de subida mediano da camada 2/3 para a camada 5 uEPSPs. D, relação entre o tempo de subida EPSP unitário da camada 2/3 e a camada 5 e a dinâmica de pulso emparelhado. A linha representa uma regressão linear (r 2 = 0.23, n = 140), e indica a transformação de facilitação de pulso pareado para depressão conforme aumenta o tempo de subida (linhas de queda indicam um ponto de unidade de 3,14 ms), e os símbolos coloridos mostram a proporção média de pulso pareado de uEPSPs com tempos de subida mais rápidos (vermelho) ou mais lento (azul) do que 3,14 ms. E, a proporção de pulso emparelhado de EPSPs simulados baseados em condutância registrados somaticamente (gEPSPs) gerados em locais em toda a árvore dendrítica apical é próxima de um. A inserção mostra que o tempo de subida do gEPSP dendrítico somático, mas não local, aumenta à medida que os eventos são gerados a partir de locais dendríticos apicais cada vez mais remotos (as linhas são ajustes monoexponenciais n = 21).

Em seguida, exploramos como as sinapses da camada 2/3 à camada 5 e da camada 5 à camada 5 respondem a trens de potenciais de ações pré-sinápticas, gerados em frequências fixas entre 10 e 50 Hz (Fig. 2). Para nossa surpresa, as uEPSPs da camada 2/3 à camada 5 mostraram depressão dependente da frequência pronunciada, enquanto as uEPSPs da camada 5 à camada 5 não exibiram depressão e foram geradas de forma confiável ao longo de trens de 50 potenciais de ação (Fig. 2). Nas conexões da camada 2/3 para a camada 5, a magnitude da depressão uEPSP aumentou de forma exponencial (Fig. 2UMA e B ) e o curso do tempo da depressão se acelerou (Fig. 2C ) à medida que a frequência de apresentação do potencial de ação aumentava. A análise revelou que em frequências de disparo pré-sináptico acima de 10 Hz, camada 2/3 a camada 5 uEPSPs deprimido para quase o estado estacionário após os primeiros 10 potenciais de ação de um trem, sugerindo uma estreita faixa dinâmica de operação (Fig. 2C , inserção). Em contraste, descobrimos que uEPSPs da camada 5 à camada 5 exibiram uma ampla faixa dinâmica, respondendo em média com igual eficácia a trens de potenciais de ação gerados em uma ampla faixa de frequência (10 & # x0201350 Hz Fig. 2UMA e B ) Na verdade, observamos que este comportamento de passagem de banda foi mantido para uEPSPs evocados ao longo de trens de pico regulares, de modo que as amplitudes dos últimos 10 uEPSPs foram próximas à amplitude do primeiro uEPSP do trem para todas as frequências testadas (proporção do último 10 ao primeiro uEPSP: 10 Hz, 1,02 e # x000b1 0,13 20 Hz, 1,32 e # x000b1 0,26 30 Hz, 1,36 e # x000b1 0,33 40 Hz, 1,36 e # x000b1 0,32 50 Hz, 1,07 e # x000b1 0,31 n = 6).

UMA, média da camada sobreposta 2/3 à camada 5 (esquerda) e da camada 5 à camada 5 (direita) EPSPs unitários evocados em resposta a um trem de 50 potenciais de ação entregues nas frequências indicadas. B, dependência de freqüência específica da via de transmissão sináptica. Observe as fortes características dependentes de frequência da camada 2/3 para a camada 5 e as características de passagem de banda das conexões da camada 5 para a camada 5 (a amplitude média indica a amplitude média em todo o trem de potencial de ação), equipado com uma única ordem exponencial e arbitrária de segunda ordem função polinomial, respectivamente. C, cinética dependente da frequência da depressão sináptica da camada 2/3 à camada 5. Os dados agrupados ilustram a amplitude de EPSPs unitários evocados durante um trem de potencial de ação de 50 distribuído em 10 & # x0201350 Hz (incrementos de 10 Hz, média de nove conexões). As linhas vermelhas são ajustes bi-exponenciais aos dados. A inserção mostra a relação entre a constante do potencial de ação (segunda constante mais longa) de depressão e a frequência de disparo.

EPSPs unitários evocados por complexos trens de pico

Em seguida, examinamos como as sinapses excitatórias intracorticais processam padrões complexos de disparo do potencial de ação pré-sináptica. Observações anteriores indicaram que os neurônios neocorticais de diversas áreas corticais sensoriais respondem a estímulos sensoriais ideais com saídas de potencial de ação que caracteristicamente têm taxas médias baixas (10 & # x0201320 Hz), mas padrões de disparo irregulares e, portanto, têm distribuições amplas de frequências interpiques (& # x0003c 1 a & # x0003e 200 Hz) (ver deCharms & # x00026 Zador, 2000 para uma análise abrangente de dados de várias regiões corticais). Nós, portanto, investigamos como as propriedades dependentes de uso impactam na transmissão sináptica de trens de potencial de ação que possuíam intervalos entre pontos variáveis, mas uma taxa média geral baixa. Trens de pico compostos de 50 potenciais de ação foram gerados em uma frequência fixa (10 Hz), com uma distribuição de Poisson modificada composta de frequências interpiques entre 2 e 250 Hz (média, mediana de 10 Hz, 16,1 Hz para distribuição de frequência instantânea ver Fig Suplementar . 2), ou como rajadas repetidas de 10 potenciais de ação gerados a 50 Hz (média, mediana de 10 Hz, 49,5 Hz) (Fig. 3). As conexões da camada 2/3 à camada 5 responderam de forma otimizada ao trem de frequência fixa de potenciais de ação, mas significativamente menos eficaz ao trem de Poisson e ao padrão de descarga de explosão (amplitude uEPSP cumulativa: frequência fixa, 29,3 & # x000b1 7,3 mV Poisson, 24,6 & # x000b1 6,1 mV, P & # x0003c 0,01 burst, 16,1 & # x000b1 3,3 mV, P & # x0003c 0,01 n = 13 Fig. 3UMA e B ) Para explorar como as propriedades dependentes do uso da transmissão da camada 2/3 para a camada 5 controlavam a amplitude dos uEPSPs ao longo do trem de pico de Poisson, examinamos a relação entre a frequência de disparo instantâneo e a amplitude da camada 2/3 à camada 5 uEPSPs, normalizado para o primeiro uEPSP do trem (agrupado para 13 conexões Fig. 3C ) Em qualquer ponto do trem de pico de Poisson, o disparo pré-sináptico em altas frequências instantâneas evocou uEPSPs deprimidos, enquanto o disparo em frequências instantâneas baixas evocou respostas de amplitude maior, sugerindo que as dinâmicas dependentes de frequência e uso estão operacionais em todos os trens de pico (Fig. 3C ) Além disso, quando traçamos a amplitude da camada 2/3 para a camada 5 uEPSPs como uma função da frequência de disparo instantâneo, encontramos uma depressão dependente da frequência acentuada da amplitude do uEPSP, indicando que as sinapses da camada 2/3 à camada 5 se comportam como um baixo -passar filtro durante o curso de trens de pico (Fig. 3D ) Em contraste, as conexões da camada 5 para a camada 5 não exibiram depressão sináptica durante o curso desses trens de espigão (Fig. 3UMA ), mas transmitiu o trem de Poisson de forma significativamente mais eficaz do que o trem médio (amplitude uEPSP cumulativa: frequência fixa, 16,9 & # x000b1 5,4 mV Poisson, 18,1 & # x000b1 5,6, P & # x0003c 0,001 emparelhado t explosão de teste, 17,4 & # x000b1 5,5 mV, P & # x0003e 0,05 n = 8 Fig. 3UMA e B ) Descobrimos que as conexões da camada 5 para a camada 5 transmitiram o trem de Poisson efetivamente porque a transmissão sináptica foi facilitada em frequências interpiques mais altas (compare os traços sobrepostos na Fig. 3Aa e b ) Este comportamento foi aparente ao longo do curso do trem de pico de Poisson (amplitude uEPSP normalizada para o primeiro uEPSP do trem, agrupado por 8 conexões Fig. 3C e D ) Portanto, em contraste com o caminho da camada 2/3 para a camada 5, as sinapses da camada 5 para a camada 5 se comportam como um filtro passa-alta durante o curso dos trens de pico (Fig. 3D ).

UMA, registros contínuos em média da camada 5 à camada 5 (preto) e da camada 2/3 à camada 5 (vermelho) EPSPs unitários evocados em resposta a trens de pico de igual número, gerados em taxas médias idênticas, mas com diferentes graus de complexidade & # x02013 denominado regular (mediana, 10 Hz), Poisson (mediana, 16 Hz) e burst (mediana, 49,5 Hz). Observe que, em resposta ao trem de Poisson, a amplitude da camada 5 para a camada 5 uEPSPs aumentou após o primeiro uEPSP (linha horizontal tracejada), enquanto a amplitude da camada 2/3 para a camada 5 uEPSPs diminuiu, este comportamento também é aparente durante cada resposta de burst . Seções dessas respostas são mostradas para maior clareza em uma base de tempo mais rápida (Aa e b) Observe a marcada facilitação da camada 5 para a camada 5 uEPSPs, mas a depressão da camada 2/3 para a camada 5 uEPSPs (Vpublicar) quando gerado em altas frequências de disparo instantâneo (Vpré) Essas conexões representativas foram escolhidas porque o primeiro uEPSP de cada trem tinha uma amplitude semelhante. B, dados resumidos mostrando que a amplitude uEPSP cumulativa diminui em resposta a trens de pico complexos (trens de Poisson e burst) gerados na camada 2/3 à camada 5 (n = 13), mas aumenta nas conexões da camada 5 para a camada 5 (n = 8). C, dados agrupados que descrevem a evolução do tempo da relação entre a amplitude uEPSP normalizada e a frequência de disparo instantâneo (cinza) durante o trem de pico de Poisson para a camada 2/3 à camada 5 (vermelho n = 13) e da camada 5 à camada 5 (preto n = 8) conexões. Cada ponto representa a amplitude dos uEPSPs calculados entre as conexões e plotados como uma fração do primeiro uEPSP do trem. D, relação entre a amplitude do uEPSP e a frequência instantânea do potencial de ação. Observe a pronunciada depressão dependente da frequência na camada 2/3 para a camada 5 (vermelho) e facilitação nas conexões da camada 5 para a camada 5 (preto). Freqüências instantâneas & # x0003e 75 Hz não são mostradas.

Liberação sustentada durante complexos trens de potencial de ação

Em animais que se comportam, neurônios piramidais neocorticais estão embutidos em redes neuronais ativas que disparam padrões de potenciais de ação espontâneos e evocados por estímulo (Hubel, 1959 Porter et al. 1971 Krupa et al. 2004 Luna et al. 2005). Procuramos explorar como as sinapses excitatórias intracorticais sustentam a liberação do transmissor sob tais condições de uso contínuo. Observações anteriores de animais imaturos indicaram que as sinapses da camada excitatória 2/3 à camada 5 e da camada 5 à camada 5 são incapazes de liberação sustentada quando ativadas repetidamente em frequências acima de 10 Hz (Galarreta & # x00026 Hestrin, 1998). Portanto, desenvolvemos um protocolo para se assemelhar à transição do disparo do potencial de ação de baixa frequência em curso aparente nos córtices sensoriais na ausência de entrada sensorial (Hubel, 1959 Luna et al. 2005 Crochet & # x00026 Petersen, 2006 de Kock et al. 2007) para um trem de alta frequência de potenciais de ação representativos de uma resposta sensorial evocada. Usamos uma resposta sensorial registrada anteriormente obtida de um neurônio em uma área cortical visual de um macaco acordado, que possuía uma ampla gama de frequências interpiques e era de longa duração, para testar se as sinapses intracorticais poderiam sustentar a liberação durante o curso de um prolongado e padrão complexo de disparo do potencial de ação pré-sináptica & # x02013 nos referimos a este padrão de atividade como o trem de pico complexo (frequência média, coeficiente de variação de 47,6 Hz (CV), intervalo de 0,75 de frequências interspike, 11 & # x02013245 Hz 92 potenciais de ação para instantâneo distribuição de frequência, consulte a Fig. 2 Suplementar e a Fig. 4 dos Métodos.UMA e C traço superior).Este protocolo de estímulo foi repetido continuamente para investigar a dinâmica da transmissão excitatória sob condições de uso contínuo ao longo de um período entre 33 e 86 min (duração de cada tentativa, 126 s repetido em média 28 vezes na faixa, 16 & # x0201341 n = 46 conexões unitárias Fig. 4).

Observamos que a capacidade das sinapses intracorticais de sustentar a liberação ao longo do curso do complexo spike train era específica para a via (Fig. 4). Quando uEPSPs foram evocados entre os neurônios piramidais da camada 2/3 à camada 5, o disparo do potencial de ação de baixa frequência resultou em uEPSPs que eram confiáveis ​​do potencial de ação ao potencial de ação, exibindo apenas falha ocasional de transmissão (taxa de falha percentual a 1 Hz, 5,8 & # x000b1 1,8% n = 28). Por outro lado, no início do complexo spike train, a amplitude dos uEPSPs foi dramaticamente diminuída nos primeiros potenciais de ação para atingir um estado estacionário de 4,4 & # x000b1 1,0% (últimos 40 potenciais de ação do complexo spike train em relação a 1 Hz n = 28 Fig. 4UMA e C ) Tanto o curso do tempo quanto a magnitude desta forma de depressão dependente do uso foram consistentes de tentativa para tentativa em cada conexão (Fig. 4C ) e entre conexões unitárias (1 Hz, 377,3 & # x000b1 40,3 & # x003bcV últimos 40 potenciais de ação do trem de pico complexo, 11,7 & # x000b1 2,4 & # x003bcV P & # x0003c intervalo de 0,0001: 79,29 & # x0201399,95% de redução n = 28 Fig. 4D , símbolos vermelhos). Isso nos permitiu ajustar a evolução da depressão sináptica com uma única função exponencial com uma constante de tempo de depressão, medida em número de picos, de apenas 3,4 potenciais de ação (Fig. 4D , linha preta). Após o término do complexo spike train, a estimulação de baixa frequência foi reiniciada, permitindo que o curso de tempo de recuperação da depressão fosse seguido (Fig. 4UMA e D ) A amplitude dos uEPSPs se recuperou com uma constante de tempo de 0,75 s, para atingir um nível significativamente maior do que o aparente antes do complexo trem de pico (20 potenciais de ação antes, 377,3 & # x000b1 40,3 & # x003bcV 20 potenciais de ação depois, 487,5 & # x000b1 57,0 & # x003bcV 128,7 & # x000b1 4,5% de aumento P & # x0003c 0,0001 n = 28). Esta forma de aumento sináptico decaiu lentamente com um curso de tempo exponencial (& # x003c4 = 40,4 s). As conexões sinápticas da camada 2/3 à camada 5, portanto, não sustentam a operação ao longo do curso de um trem de pico complexo gerado sob condições de uso contínuo. Para explorar se os aspectos desse comportamento resultavam dos intervalos altamente irregulares entre os picos durante o complexo trem de picos, em vez disso, geramos um trem de potenciais de ação evocados regularmente na mesma taxa média de disparo (Fig. 5). Em comum com o trem de pico complexo, a camada 2/3 à camada 5 uEPSPs mostrou depressão pronunciada em resposta a um padrão de disparo regular gerado a 47,6 Hz, para atingir um estado estacionário de 5 & # x000b1 0,05% (últimos 40 potenciais de ação do trem de pico em relação a 1 Hz n = 5 Fig. 5UMA ), que foi seguido por um período de transmissão aumentada em 1 Hz (162,1 & # x000b1 2,6% de aumento n = 5). É interessante, entretanto, que a depressão evoluiu durante o trem de pico médio com uma constante de tempo de 9,9 potenciais de ação, que é mais lento do que em resposta ao trem de pico complexo. Isso indica que o potencial de ação disparando em alta frequência instantânea durante o início do trem de pico complexo rapidamente engatou a depressão dependente da frequência da camada 2/3 para as sinapses da camada 5 que foi mantida ao longo do trem de pico. Descartamos a possibilidade de que essas propriedades da depressão sináptica estivessem relacionadas ao modo como o disparo do potencial de ação era evocado durante os complexos spike trens. Em vez de evocar cada pico com um pulso de corrente curto, geramos trens de disparos de potencial de ação em resposta a uma entrada sináptica excitatória composta de uma barragem de EPSCs simulados entregues como uma fonte de corrente ideal para a soma da camada 2/3 ou camada 5 piramidal neurônios, que conduziram disparos reprodutíveis de tentativa a tentativa (Mainen & # x00026 Sejnowski, 1995 Harsch & # x00026 Robinson, 2000 Williams, 2005) (frequência EPSC, amplitude EPSC unitária de 500 Hz, 200 ou 300 pA & # x003c4subir= 0,2 ms & # x003c4decair= 2 ms 31 & # x000b1 5 repetições para distribuição de frequência instantânea, consulte a Fig. 2 suplementar n = 5 Fig. 6B , traços inferiores). Quando desafiado com esta forma de padrão de disparo de potencial de ação, a camada 2/3 à camada 5 uEPSPs exibiu depressão sináptica rápida e forte (frequência de disparo média, 57 & # x000b1 constante de potencial de ação de 5 Hz de depressão, 3,4 deprimido para um estado estacionário de 5,0 e # x000b1 1,3% da amplitude inicial n = 5 Fig. 6C ) Em contraste, as conexões sinápticas da camada 5 para a camada 5 transmitiram de forma robusta tais trens de pico sintéticos de alta frequência (frequência média de disparo, 49 & # x000b1 2 Hz n = 5 Fig. 6C ).

UMA, as sinapses da camada 2/3 à camada 5 operam de maneira otimizada em baixa frequência (1 Hz ^), mas a amplitude de EPSPs unitários diminui muito no início de um trem de pico regular de alta frequência (símbolos vermelhos 47,6 Hz 92 potenciais de ação) para atingir um valor de estado estacionário de 5 & # x000b1 0,05% (últimas 40 respostas do trem n = 5). A amplitude de EPSP unitária foi normalizada para as primeiras 10 respostas evocadas a 1 Hz em cada conexão. B, sob condições iônicas extracelulares de controle (2 mm Ca 2+ / 1 mm Mg 2+), a amplitude da camada 5 à camada 5 uEPSPs facilita no início de um trem de pico de alta frequência idêntico (símbolos vermelhos) e é mantida em um nível facilitado nível ao longo do trem (171,4 & # x000b1 2,1%, últimas 40 respostas do trem n = 7). Um aumento nos níveis de cálcio extracelular (alto Ca 2+ 4 m m Ca 2+ / 1 m m Mg 2+ n = 3) resultou no aparecimento de depressão sináptica durante o curso do trem de pico de alta frequência (linha preta contínua, barras de erro de andamento negativo). As inserções em UMA e B mostram exemplos representativos de uEPSPs evocados pelo trem de pico de alta frequência nessas vias sob condições iônicas de controle.

UMA, propriedades da transmissão sináptica da camada 2/3 para a camada 2/3. Observe a depressão sináptica pronunciada após a transição de uma baixa frequência (1 Hz, símbolos abertos) para um padrão complexo de padrão de disparo de potencial de ação (símbolos vermelhos), a linha é uma função monoexponencial com & # x003c4 = 3,3 potenciais de ação (n = 7 conexões). A inserção mostra EPSPs unitários sobrepostos evocados durante o complexo trem de pico. B, padrões aleatórios de disparo de potencial de ação (Vpré, cinco registros sobrepostos) evocam uma depressão rápida e forte da camada 2/3 à transmissão sináptica da camada 5 (Vpublicar traços pretos, ensaios sequenciais traço vermelho, média de 40 repetições). C, dinâmica de transmissão específica da via evocada pela geração de padrões aleatórios de disparos de potencial de ação na camada 2/3 para a camada 5 (^, n = 5) e da camada 5 à camada 5 (& # x02022, n = 5) conexões (dados normalizados em cada conexão ao primeiro EPSP unitário do trem). Observe a pronunciada depressão sináptica da camada 2/3 à camada 5, cuja evolução foi bem aproximada com uma função monoexponencial (linha vermelha & # x003c4 = 3,4 potenciais de ação).

As conexões sinápticas da camada 5 à camada 5 foram capazes de liberação robusta do transmissor ao longo do curso do complexo trem de pico (Fig. 4UMA e C ) Em contraste com as conexões da camada 2/3 para a camada 5, os uEPSPs evocados a 1 Hz entre os neurônios piramidais da camada 5 mostraram uma alta taxa de falha (33,5 & # x000b1 4,2% n = 18), sugerindo que o caminho da camada 5 transmite taxas de baixa frequência de maneira não confiável. Após a transição para o trem de pico complexo, no entanto, a amplitude dos uEPSPs aumentou ao longo dos primeiros potenciais de ação do trem para 215,7 & # x000b1 19,0% daquele gerado em 1 Hz (intervalo, 109,0 & # x02013402,9% de amplitude em 1 Hz, 258,0 & # x000b1 37,7 & # x003bcV facilitação, 496,7 & # x000b1 60,9 & # x003bcV n = 18 Fig. 4C e E símbolos vermelhos). É notável que à medida que o complexo spike train evoluiu, a amplitude dos uEPSPs não diminuiu (média ao longo do trem complexo, 261,8 & # x000b1 43,5 & # x003bcV primeiros 20 potenciais de ação, 302,5 & # x000b1 44,7 & # x003bcV: últimos 20 potenciais de ação , 244,5 & # x000b1 41,8 & # x003bcV n = 18 Fig. 4E ) Em conexões únicas, o padrão de facilitação de uEPSP da camada 5 para a camada 5 foi estável de teste para teste e uEPSPs mensuráveis ​​foram gerados em todo o complexo de spike train (compare a Fig. 4C painéis esquerdo e direito). Da mesma forma, durante o curso de longos trens de pico gerados regularmente na frequência média do trem de pico complexo (trem de 47,6 Hz), a facilitação da camada 5 para a camada 5 uEPSPs foi mantida durante toda a duração do trem (92 potenciais de ação primeiros 20 potenciais de ação em comparação com 1 Hz, 187,5 & # x000b1 5,5% últimos 20 potenciais de ação, 167,2 & # x000b1 2,8% de amplitude a 1 Hz, 214,2 & # x000b1 5,1 & # x003bcV primeiros 20 potenciais de ação do trem de pico, 373,9 & # x000b1 10,9 & # x003bcV n = 7 Fig. 5B ) Além disso, descobrimos que quando o trem de pico complexo foi reproduzido duas vezes em sucessão próxima (atraso de 20 ms), a amplitude da camada 5 para a camada 5 uEPSPs evocada durante a primeira e segunda repetição do trem de pico complexo não diminuiu em comparação com uEPSPs gerado a 1 Hz (1 Hz: faixa, mediana de 32 & # x02013699 & # x003bcV, 90,8 & # x003bcV primeiro trem de pico complexo (92 potenciais de ação): faixa, 66 & # x02013604 & # x003bcV mediana, 197,8 & # x003bcV segundo trem de pico complexo (92 potenciais de ação): alcance, 49,3 & # x02013404 & # x003bcV mediana, 167,4 & # x003bcV Kruskal & # x02013 teste de Wallis, P & # x0003e 0,71 n = 7 Mann & # x02013 Whitney você teste entre o primeiro e o segundo trem, P & # x0003e 0,38). Embora esses dados não abordem os limites de transmissão sustentada nas conexões da camada 5 para a camada 5, eles indicam que essas sinapses podem sustentar a liberação de neurotransmissores em altas frequências de disparo de potencial de ação (média, 47,6 Hz) para pelo menos 184 potenciais de ação.

Para explorar se outros alvos sinápticos de neurônios piramidais de camada 2/3 exibem depressão sináptica dependente de frequência, gravamos uEPSPs entre pares de neurônios piramidais de camada 2/3. Em comum com as conexões da camada 2/3 para a camada 5, a camada unitária 2/3 para a camada 2/3 EPSPs mostrou depressão rápida e forte após a transição de baixa frequência para padrões de disparo de potencial de ação complexo (constante de potencial de ação, 3,3 1 Hz, 387,5 & # x000b1 3.6 & # x003bcV últimos 40 potenciais de ação do trem complexo, 13.1 & # x000b1 2.0 & # x003bcV n = 7), mas recuperou rapidamente para um nível aumentado após o reaparecimento da atividade de baixa frequência (recuperação, & # x003c4 = 1,29 s 1 Hz antes, 387,5 & # x000b1 3,6 & # x003bcV 1 Hz 20 potenciais de ação depois, 524,9 & # x000b1 11.2 e # x003bcV P & # x0003c 0,0001 n = 7 Fig. 6UMA ) Esses dados indicam que a transmissão sináptica deprime fortemente nos alvos sinápticos supra e infra-granulares dos neurônios piramidais da camada 2/3 quando desafiados por sequências de espículas prolongadas.

Para examinar os mecanismos subjacentes a esta forma de depressão, primeiro examinamos se a depressão foi causada por uma falha na liberação do transmissor ou pela dessensibilização e / ou saturação dos receptores AMPA pós-sinápticos (Trussell et al. Prata de 1993 et al. 2003). A depressão sináptica nas conexões sinápticas da camada 2/3 à camada 5 foi insensível ao bloqueio da dessensibilização do receptor AMPA com ciclotiazida (CTZ 100 & # x003bc m) ou ao antagonismo parcial do receptor dos receptores AMPA com ácido cinurênico (1 mm) (depressão com CTZ: constante de potencial de ação, 2,8 amplitude a 1 Hz, 643,2 & # x000b1 3,6 & # x003bcV últimos 40 potenciais de ação do trem complexo, 36,6 & # x000b1 6,9 & # x003bcV depressão com ácido cinurênico: constante de potencial de ação, 2,3 amplitude a 1 Hz, 187,1 & # x000b1 4.7 & # x003bcV últimos 40 potenciais de ação do trem complexo, 14,3 & # x000b1 2.7 & # x003bcV na presença contínua de ácido d -2 - (& # x02013) -amino-5-fosfonopentanóico (100 & # x003bc m ) Suplementar Fig. 3. Tomados em conjunto, esses dados sugerem que as propriedades específicas da via e dependentes do uso da transmissão excitatória intracortical têm um locus pré-sináptico.

A modulação revela diferenças mecanicistas entre sinapses intracorticais excitatórias

Uma diferença saliente entre as sinapses excitatórias intracorticais é sua capacidade de transmitir atividade de baixa frequência (Figs 1 e # x02013 6). Nossa hipótese é que a transmissão fiel de baixa frequência na camada 2/3 para a camada 2/3 para os circuitos da camada 5 foi devido a uma probabilidade de liberação relativamente alta (Pr) nesta sinapse distribuída (Abbott et al. 1997 Tsodyks & # x00026 Markram, 1997 Silver et al. 2003 Abbott & # x00026 Regehr, 2004). Para investigar se a modulação de Pr impactou nas propriedades dependentes do uso das sinapses da camada 2/3 à camada 5, registramos uEPSPs sob condições iônicas padrão (2 mm Ca 2+ / 1 mm Mg 2+) e na presença de baixa [ Ca 2+]o (1 m m Ca 2+ / 2 m m Mg 2+). A substituição iônica mudou a dinâmica da atividade sináptica evocada durante o uso contínuo, diminuindo a amplitude da camada 2/3 para a camada 5 uEPSPs evocadas em baixa frequência para 37,2 & # x000b1 2,7% do controle (n = 6 Fig. 7UMA ) e transformar o padrão de depressão sináptica durante o trem de pico complexo, desacelerando o curso do tempo e diminuindo a magnitude da depressão (controle: constante de potencial de ação, 2,7 amplitude a 1 Hz, 847,3 & # x000b1 4,1 & # x003bcV últimos 40 potenciais de ação de trem complexo, 57,0 & # x000b1 6,7 & # x003bcV 1 mm Ca 2+ / 2 mm Mg 2+: constante de potencial de ação, amplitude 142,7 a 1 Hz, 313,4 & # x000b1 3,3 & # x003bcV últimos 40 potenciais de ação do trem de pico complexo , 153,5 e # x000b1 11,2 e # x003bcV n = 6 Fig. 7UMA e B ) Esses dados indicam que os axônios dos neurônios piramidais da camada 2/3 são capazes de transmitir potenciais de ação em altas frequências (Fig. Suplementar 4) e mostram que uma modulação da probabilidade de liberação do transmissor pode alterar a capacidade da camada 2/3 para a camada 5 sinapses para sustentar a liberação do transmissor durante o curso de longos trens de pico. Para nossa surpresa, esta redução da depressão sináptica foi acompanhada por um aumento dramático do aumento sináptico na terminação de trens de picos complexos (controle, 1,54 & # x000b1 0,11 1 m m Ca 2+ / 2 m m Mg 2+, 2,34 & # x000b1 0,37 P & # x0003c 0,02 controle: decaimento, & # x003c4 = 33,0 s 1 m m Ca 2+ / 2 m m Mg 2: decaimento, & # x003c4 = 20,0 s n = 6 Fig. 7B ) Uma mudança mais conservadora de [Ca 2+ / Mg 2+]o a 1,5 / 1,5 m m, teve efeitos menos pronunciados, embora estatisticamente significativos, sobre a dinâmica da camada 2/3 para a camada 5 uEPSPs (n = 5 Fig. 7D e E ) Por outro lado, descobrimos que um aumento na probabilidade de liberação nas sinapses da camada 5 para a camada 5, produzido pela mudança de [Ca 2+ / Mg 2+]o a 4 mm Ca 2+ / 1 mm Mg 2+, transformou a capacidade dessas sinapses de sustentar a liberação durante o curso de longas sequências de espículas, revelando a presença de depressão sináptica (últimos 40 potenciais de ação em comparação com 1 Hz: controle, 171,4 e # x000b1 2,1% n = 7 4 m m Ca 2+ / 1 m m Mg 2+, 49,3 & # x000b1 0,1% n = 3 P & # x0003c 0,001 Fig. 5B ) Deve-se notar, no entanto, que o grau de depressão sináptica aparente nas sinapses da camada 5 à camada 5 reveladas sob condições de Pr aumentado foi modesto em comparação com a magnitude da depressão nas sinapses da camada 2/3 à camada 5 sob condições iônicas de controle ( compare a Fig. 5UMA e B ).

UMA, registros de tensão contínua de EPSPs unitários (Vpublicar) evocado no controle (2 m m Ca 2+ / 1 m m Mg 2+) e na presença extracelular de 1 m m Ca 2+ / 2 m m Mg 2+. Os traços inferiores mostram respostas sequenciais únicas e médias evocadas pelo trem de pico complexo nas condições indicadas. B, a magnitude e o curso de tempo da depressão sináptica durante o trem de pico complexo no controle (linha azul) e 1 m m Ca 2+ / 2 m m Mg 2+ (1 Hz, complexo de símbolos abertos, símbolos vermelhos). Os dados de cada conexão foram normalizados nas condições indicadas para os primeiros 10 uEPSPs gerados a 1 Hz. As linhas pretas são ajustes monoexponenciais para a evolução da depressão. C, o baclofeno diminui fracamente a depressão sináptica (símbolos abertos e vermelhos) em relação ao controle (linha azul). As linhas pretas são ajustes monoexponenciais para a evolução da depressão através do complexo trem de espigões. D, dados resumidos que descrevem a modulação da depressão sináptica. Os valores representam a razão do grau de depressão sináptica no controle e os valores de condição de teste indicados & # x0003e 1 representam uma redução da depressão. O número de conexões e significância estatística (*, P & # x0003c 0,05 Aluno emparelhado t teste). E, a redução da amplitude EPSP unitária evocada em baixa frequência (razão de 1 Hz de controle / condição, valores & # x0003e 1 indicam redução) está relacionada à magnitude do aumento sináptico (razão de condição / controle, valores & # x0003e 1 indicam aumento) . A área sombreada em cinza delineia as condições que são estatisticamente significativas para ambos os parâmetros, o ácido quinurênico (1 m m, vermelho) reduziu significativamente a amplitude do EPSP unitário, mas não alterou o aumento sináptico.

Como uma próxima etapa, examinamos se a modulação de Pr pela ativação de sistemas de neurotransmissores controlava o comportamento dinâmico das sinapses da camada 2/3 à camada 5. O aplicativo de banho do GABAB agonista do receptor baclofen (1 & # x003bc m) (Vigot et al. 2006) diminuiu a amplitude da camada 2/3 para a camada 5 uEPSPs evocados em baixa frequência em um grau semelhante à diminuição [Ca 2+]o (% de controle, 39,1 & # x000b1 6,9 P & # x0003c 0,03 n = 9). Por outro lado, o baclofeno modulou apenas fracamente a transmissão de trens de picos complexos, desacelerando modestamente o curso do tempo e diminuindo a magnitude da depressão sináptica (controle: constante de potencial de ação, 3,1 depressão, 11,2 & # x000b1 2,6% em relação a 1 Hz baclofeno: potencial de ação constante, 11,4 depressão, 23,1 & # x000b1 5,8% P & # x0003c 0,01 n = 9 Fig. 7C ) O aumento após o complexo trem de pico foi, no entanto, fortemente facilitado (controle, 1,41 & # x000b1 0,08 baclofen, 2,17 & # x000b1 0,31 P & # x0003c 0,02 controle: decadência, & # x003c4 = 74,0 s baclofen: decaimento, & # x003c4 = 26,0 s n = 9 Fig. 7C ) Em resumo, encontramos uma relação estreita entre a capacidade das sinapses da camada 2/3 à camada 5 de transmitir fielmente a atividade de baixa frequência e o grau de aumento sináptico (r 2 = 0,98 probabilidade não correlacionada, P & # x0003c 0,0002 Fig. 6E )A modulação da transmissão de baixa frequência, entretanto, não prediz o grau de depressão sináptica em frequências mais altas de ativação.

Em contraste com a ativação dos sistemas de neurotransmissores pré-sinápticos, descobrimos que um amplo espectro de antagonista do glutamato metabotrópico (1 ou 10 & # x003bc m (2S) -2-amino-2 - [(1S,2S) -2-carboxicicloprop-1-il] (xanth-9-il) ácido propanóico (<"tipo": "entrez-nucleotídeo", "attrs": <"text": "LY341495", "term_id": "1257705759 "," term_text ":" LY341495 ">> LY341495) (n = 7) ou receptores canabinoides tipo 1 (10 & # x003bc m N- (piperidin-1-il) -5- (4-iodofenil) -1- (2,4, diclorofenil) -4-metil-1H-pirazol-3-carboxamida (AM 251) (n = 3) não teve influência na dinâmica da transmissão sináptica, sugerindo que nem o transbordamento de glutamato nem a formação de um sinal retrógrado dependente de endocanabinoide para locais pré-sinápticos são influentes em nossas condições experimentais (Fig. 7D e E ) Além disso, as manipulações do potencial da membrana somática não modulam a transmissão sináptica na camada 2/3 para os circuitos da camada 5 (repouso, 79,9 & # x000b1 2,2 mV despolarizado, 53,3 & # x000b1 2,5 mV n = 5 Fig. 7D e E ) (Alle & # x00026 Geiger, 2006 Shu et al. 2006). Da mesma forma, alteração da amplitude e forma dos potenciais de ação pré-sináptica, pela inclusão do bloqueador do canal de potássio 4-aminopiridina (4-AP 2 m m) na solução intrapipeta (Debanne et al. 1997), não conseguiu alterar a dinâmica da transmissão sináptica (n = 7 Suplementar Fig. 5).

Em seguida, investigamos se a dinâmica da transmissão excitatória nas sinapses da camada 2/3 à camada 5 poderia ser influenciada pela indução de mudanças de eficácia sináptica de longo prazo. Mudanças de eficácia sináptica de longo prazo podem ser evocadas em sinapses excitatórias intracorticais usando protocolos dependentes do tempo de pico, com o sinal (potenciação ou depressão) dependente da ordem temporal de disparo pré e pós-sináptico (Markram & # x00026 Tsodyks, 1996 Sjostrom et al. 2001, 2003). Como a depressão de longo prazo (LTD) foi encontrada para ser mediada predominantemente por mecanismos pré-sinápticos no neocórtex (Sjostrom et al. 2003), examinamos se a indução de LTD poderia modular as propriedades dinâmicas da camada 2/3 para a transmissão sináptica da camada 5 (Fig. 8). Em apoio às observações anteriores, observamos que o sinal de mudanças de longo prazo da amplitude da camada 2/3 para a camada 5 uEPSP quando evocado em baixa frequência (0,2 Hz) foi sensível ao tempo de disparo do potencial de ação pré e pós-sináptica durante um período de indução (260 potenciais de ação no controle de 1 Hz, pré-sináptica não emparelhada com disparo de potencial de ação pós-sináptica: 0,94 & # x000b1 0,06 da linha de base uEPSP amplitude 34 & # x0201338 min após o protocolo de indução n = 5 potenciação de longo prazo, pré-sináptica precedida pós-sináptica em 10 ms: 1,53 & # x000b1 0,22 28 & # x0201332 min após a indução P & # x0003c 0,05 n = 5 LTD, pós-sináptica precedida pré-sináptica por 10 ms: 0,78 & # x000b1 0,07, 34 & # x0201338 min após a indução P & # x0003c 0,05 n = 9 Fig. 8UMA ) Nas conexões da camada 2/3 à camada 5 que exibiram LTD estável, exploramos se a depressão sináptica durante prolongados e complexos trens de picos foi alterada. Encontramos em neurônios onde o LTD foi estabelecido, uma redução significativa na magnitude da depressão sináptica durante e um aumento no aumento sináptico após o complexo spike train, em relação às conexões que foram registradas por um período de tempo semelhante e estavam sujeitas a um protocolo de indução pré-sináptica idêntico que não foi pareado com disparo pós-sináptico (depressão durante o trem, porcentagem de atividade de 1 Hz: controle, 4,4 & # x000b1 0,4% LTD, 24,5 & # x000b1 13,2% P & # x0003c 0,005, Mann & # x02013Whitney você aumento de teste: controle: 1,18 e # x000b1 0,11 LTD: 1,62 e # x000b1 0,10 P & # x0003c 0.03, Mann & # x02013Whitney você controle de teste: n = 5 LTD: n = 6 Fig. 8B e C ) LTD pode, portanto, alterar a dinâmica da transmissão sináptica da camada 2/3 para a camada 5, reduzindo a transmissão em baixa frequência (Fig. 8UMA ), mas diminuindo o grau de depressão sináptica aparente durante os períodos de ativação de alta frequência (Fig. 8B e C ).

UMA, potenciação e depressão de longo prazo (LTD) da camada 2/3 à amplitude unitária de EPSP da camada 5. No tempo zero, um protocolo de emparelhamento de disparo de potencial de ação pré e pós-sináptico foi aplicado (a diferença no tempo é de 10 ms 260 conexões de controle de potenciais de ação recebidas apenas disparo pré-sináptico). A amplitude dos EPSPs foi normalizada para valores de pré-indução em cada conexão. B, a indução de LTD (vermelho) diminuiu o grau de depressão sináptica durante e aumentou a magnitude do aumento após a apresentação do trem de pico complexo (frequência média de 92 potenciais de ação, 47,6 Hz), em relação às conexões de controle (preto). As linhas azuis são ajustes exponenciais ao curso do tempo da depressão. C, distribuições cumulativas dos dados agrupados mostrados em B demonstrar a influência do LTD na depressão sináptica durante e no aumento após o complexo spike train.

Propriedades da camada 2/3 ao aumento sináptico da camada 5

Uma característica da dinâmica da transmissão sináptica da camada 2/3 para a camada 5 foi o período de longa duração de aumento de uEPSP após o término de padrões complexos de disparo de alta frequência (Figs 4 e # x02013 7). As propriedades de aumento sináptico foram causalmente relacionadas às do trem de pico precedente (Fig. 9). O aumento estava ausente se o complexo de espigões fosse substituído por um período de quiescência (n = 6 Fig. 9UMA e B verde), e o curso do tempo, mas não a magnitude do aumento sináptico, foi ditado pelo número de potenciais de ação no trem de pico (n = 9 Fig. 9UMA e B ) Para examinar se o aumento foi mediado por um mecanismo pré ou pós-sináptico, analisamos as distribuições de amplitude de 20 uEPSPs evocadas a 1 Hz antes e depois do trem de pico complexo em muitas tentativas em cada conexão (número médio de uEPSPs em distribuições, 443 & # x000b1 38 n = 28 conexões unitárias). O aumento foi mediado por um aumento significativo da amplitude média do uEPSP, não acompanhado por um aumento no desvio padrão das distribuições de amplitude (relação amplitude antes / depois, 1,35 & # x000b1 0,04 P & # x0003c 0,0001 desvio padrão da razão antes / depois, 1,08 & # x000b1 0,03 P & # x0003e 0,05). Consequentemente, quando plotamos a razão da amplitude média uEPSP registrada antes e depois do complexo spike train contra a razão do coeficiente de variação ao quadrado (CV 2), obtivemos resultados consistentes com um locus pré-sináptico de aumento sináptico (Faber & # x00026 Korn , 1991) (r 2 = 0,45 probabilidade não correlacionada, P & # x0003c 0,0001 Fig. 9C ).

UMA, trens complexos de disparos de potencial de ação geram aumento de longa duração da atividade sináptica da camada 2/3 de baixa frequência para a camada 5. Existe uma relação saturável entre o curso de tempo de aumento e o número de potenciais de ação em trens de picos complexos (amplitude normalizada para os primeiros 10 EPSPs unitários evocados em 1 Hz para cada conexão, as linhas contínuas mostram valores médios e as linhas verticais representam s.e.m. n = 9 conexões o número de potenciais de ação mostrado em B refere-se ao número de potenciais de ação do complexo trem de espigões). O aumento está ausente se o complexo de espigões for substituído por um período de quiescência (verde n = 6 conexões). B, a cinética de decaimento do aumento é determinada pelo número do potencial de ação. Observe a rápida queda biexponencial de aumento em resposta a 25 potenciais de ação (preto). C, o aumento é mediado por um mecanismo pré-sináptico (Pré). Gráfico das razões de amplitude média e coeficiente de variação ao quadrado (CV 2) de uEPSPs registrados antes e depois do trem de pico complexo (n = 28 conexões). A linha representa uma regressão linear (r 2 = 0,45 probabilidade não correlacionada, P & # x0003c 0,0001).

Observações anteriores demonstraram que os períodos de disparo do potencial de ação pré-sináptica sustentada podem levar ao aumento da transmissão sináptica (Swandulla et al. 1991 Delaney & # x00026 Tank, 1994 Kamiya & # x00026 Zucker, 1994 Atluri & # x00026 Regehr, 1996 Habets & # x00026 Borst, 2005). Nessas sinapses centrais e periféricas, o aumento foi encontrado para ser acompanhado por terminal elevado [Ca 2+]eu e pode ser sensível a quelantes de cálcio (Swandulla et al. 1991 Kamiya & # x00026 Zucker, 1994 Atluri & # x00026 Regehr, 1996 mas ver Wojtowicz & # x00026 Atwood, 1988 Tanabe & # x00026 Kijima, 1989, 1992). Exploramos, portanto, se a quelação do terminal [Ca 2+]eu pela difusão livre de quelantes de cálcio da pipeta de gravação pré-sináptica influenciaria o aumento da camada 2/3 para a camada 5 de transmissão sináptica. Para nossa surpresa, descobrimos que a introdução dos quelantes de cálcio BAPTA (1 m m n = 5) ou EGTA (1, 5 ou 10 m m n = 5, 14 e 6, respectivamente) não bloqueou, mas aumentou significativamente a magnitude do aumento após trens de pico complexos quando comparados com conexões de controle (ANOVA P & # x0003c 0,01 cada grupo, Dunnett's post hoc teste Fig. 10). As ações dos quelantes na magnitude do aumento foram acompanhadas por uma diminuição dependente da concentração da depressão sináptica durante o complexo spike train, sugerindo que os quelantes de cálcio alcançaram os terminais pré-sinápticos e foram influentes no controle da liberação do transmissor (Rozov et al. 2001), mas não aumento (Fig. 10B e C ).

UMA, os registros de tensão contínua mostram aumento da camada 2/3 para a camada 5 EPSPs unitários (Vpublicar) evocado a 1 Hz após a geração do trem de pico complexo. O neurônio piramidal da camada pré-sináptica 2/3 (Vpré) foi registrado com uma pipeta contendo EGTA (10 m m). B, os dados agrupados mostram a magnitude e o curso de tempo do aumento nas conexões da camada 2/3 para a camada 5 testadas com os conteúdos intrapipeta pré-sinápticos indicados (controle, n = 12 BAPTA 1 m m, n = 5 EGTA 10 m m, n = 6). Observe que os quelantes de cálcio alteraram dramaticamente a dinâmica da transmissão sináptica durante o complexo trem de pico. C, distribuições cumulativas dos dados agrupados mostrados em B demonstrar a influência dos quelantes de cálcio EGTA e BAPTA na depressão durante e no aumento após o complexo trem de pico.


Medicina Nuclear e Imagem Molecular

1.01.12.9.1 Imagem de radionuclídeo da função ventricular esquerda

A função contrátil do ventrículo esquerdo é geralmente medida pela fração do volume de sangue ejetado pela contração muscular. Com detectores de tubo Geiger-Müller sobre o coração, foi possível registrar a mudança no número de contagens de sístole para diástole usando radiotraçadores circulantes que permanecem no pool de sangue por pelo menos alguns minutos após a injeção intravenosa. A relação entre as emissões detectadas na diástole e as da sístole deu a fração de ejeção, que é de importância diagnóstica como medida da função cardíaca. Posteriormente, os métodos de estudos da função ventricular esquerda de valor clínico foram desenvolvidos no início dos anos 1970 usando a câmera Anger e a albumina humana marcada com 99m Tc que permaneceu no pool de sangue (por exemplo, Strauss et al., 1971). Quando a rotulagem de glóbulos vermelhos (Eckelman et al., 1971) tornou-se disponível por meio de kits comerciais confiáveis, os métodos de medição da fração de ejeção tornaram-se generalizados, e a aquisição múltipla foi a próxima inovação em estudos clínicos de função cardíaca (Alpert et al., 1974). Os dados de imagem da câmera Anger foram agrupados em vários intervalos acionados pela onda R do paciente e ECG # x27s. Uma exibição de vídeo do coração batendo habilitada por esta estratégia permitiu o diagnóstico de movimento anormal da parede. A transição da imagem de visualização única do ciclo cardíaco para visualizações múltiplas, colimadores especializados e, finalmente, SPECT (Capítulo 1.03) e PET ocorreu nos anos seguintes para o que hoje é conhecido como cardiologia nuclear. Atualmente, os exames de pool sanguíneo ventricular são secundários aos estudos de perfusão do músculo miocárdico, onde o volume do ventrículo esquerdo é determinado a partir do contorno da parede interna do ventrículo.


6. Observações finais

A distribuição tonotópica dos parâmetros relacionados ao tempo e a distribuição não monotônica da excitabilidade dentro do gânglio espiral correspondem bem à conhecida organização funcional do sistema auditivo periférico. Como esses parâmetros são controlados por vários tipos de canais iônicos, mecanismos regulatórios sofisticados devem estar em vigor para orquestrar sua expressão celular específica. As ações opostas do BDNF e do NT-3 a esse respeito forneceram uma grande quantidade de informações, mas ainda há muito a ser feito, particularmente com a reconciliação dos gradientes das duas neurotrofinas com a distribuição dos canais iônicos que determinam o potencial de membrana em repouso. e a tensão limite para o disparo do potencial de ação.

É claro, no entanto, que a questão colocada no início desta revisão tem uma resposta funcionalmente relevante - os neurônios do gânglio espiral possuem especializações eletrofisiológicas que podem contribuir para a codificação da informação auditiva. na Vivo. Múltiplas abordagens têm sido utilizadas para mostrar de forma convincente que as características cinéticas mudam sistematicamente ao longo do eixo tonotópico, enquanto a excitabilidade neuronal é distribuída de forma que os neurônios mais sensíveis estejam localizados na região coclear média associada à maior sensibilidade. A dualidade de tempo endógeno e sensibilidade dos neurônios do gânglio espiral e suas distribuições exclusivas ao longo do contorno tonotópico estão resumidas na Figura 8. Sobreposto a um grupo de neurônios do gânglio espiral corado com & # x003b2-tubulina (perfis de cinza) está a sensibilidade heterogênea e aprimorada na região de frequência médio-apical representada pelo alongamento das barras de escala em direção a um nível de intensidade inferior e o maior número de afinação curvas. Simultaneamente, há uma progressão suave de recursos de disparo "lento" para "rápido" que são graduados suavemente da região de baixa frequência (esquerda) para a região de alta frequência (direita) denotada pelos símbolos de notas musicais que marcam as pontas da afinação curvas. O sofisticado ajuste fenotípico dos neurônios do gânglio espiral, sem dúvida, desempenha um papel funcional na codificação do sinal auditivo e deve ser cuidadosamente considerado ao projetar novas abordagens clínicas.

Existem dois parâmetros de especializações fenotípicas dos neurônios do gânglio espiral que variam ao longo do mapa tonotópico. O primeiro representado pelo tempo das notas musicais nas pontas das curvas de sintonia neuronal são as características cinéticas dos neurônios em limiares que variam em um gradiente linear. O segundo representado pela forma do agrupamento neuronal mostrado no fundo (cinza, corado com anticorpo anti - & # x003b2-tubulina) e a barra de escala em forma de U é a sensibilidade neuronal não monotônica. Os neurônios mais sensíveis (vermelhos na região médio-apical) têm elevados potenciais de membrana em repouso e maior excitabilidade devido a tensões de limiar reduzidas.


Materiais e métodos

Preparação de fatias

Fatias de cérebro foram preparadas a partir de ratos machos Sprague-Dawley, 35–50 d de idade. Os ratos foram anestesiados com isofluorano e decapitados, e o cérebro foi imediatamente removido e colocado em fluido espinhal cerebral artificial (ACSF) gelado, borbulhado com 95% de O2 e 5% CO2. O hipocampo foi dissecado e colocado no aparelho de corte, consistindo de um micrômetro manual e um mecanismo de corte vertical acionado pela gravidade, com a camada CA1 orientada aproximadamente paralela à lâmina de corte. Fatias (500 mícrons de espessura) foram preparadas e armazenadas em câmara umidificada com atmosfera de 95% de O2/ 5% CO2, apoiado em um quadrado de papel de filtro colocado em um prato de ACSF. As fatias foram usadas em 1–6 horas após a preparação das fatias. Os animais foram tratados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais da Universidade de Stanford.

Ultrassom

Ultrassom de onda contínua a 43 MHz e 50 W / cm 2 foi aplicado a fatias de cérebro usando uma configuração semelhante à que usamos anteriormente para nossos experimentos em células de cultura (Prieto et al., 2018), exceto que o tecido foi visualizado com um microscópio de dissecação em baixa ampliação. O fundo da câmara experimental era um filme de poliestireno de 25 mícrons, tratado com plasma com um limpador de plasma Harrick (Harrick Plasma). O ultrassom foi transmitido de baixo (através do filme de poliestireno) com o feixe de som perpendicular ao fundo da câmara. O transdutor de 43 MHz era um dispositivo customizado, calibrado conforme descrito anteriormente (Prieto et al., 2013), excitado usando um amplificador ENI 403LA (37 dB) (ENI). O volume focal do transdutor é de aproximadamente um cilindro de 90 mícrons de diâmetro por 500 mícrons de comprimento e a distância focal é de ∼4,2 mm. A configuração foi baseada no estágio de um microscópio Zeiss Axioskop-2 (Zeiss Microscopes), com o alojamento do condensador de subestágio modificado para acomodar o transdutor, de modo que a posição do transdutor pudesse ser ajustada usando os controles para alinhamento de o condensador e a posição da amostra de tecido em relação ao transdutor pode ser ajustada com o estágio do microscópio. O transdutor foi acoplado ao filme de poliestireno no fundo da câmara experimental usando um pequeno volume de água destilada mantido no lugar por um anel de borracha preso à ponta do transdutor com graxa de silicone. O volume focal do transdutor foi alinhado ao longo do eixo z usando um protocolo de eco de pulso, ajustando a altura do transdutor para maximizar o sinal de eco do fundo da câmara vazia. O foco foi alinhado no plano x-y adicionando à câmara um pequeno volume de ACSF, apenas o suficiente para cobrir o fundo da câmara, de forma que uma fina camada de solução foi espalhada sobre o fundo da câmara. Pulsos de ultrassom, de 1 s de comprimento, foram então aplicados, levantando um monte de fluido no foco do transdutor (devido à força de radiação produzida pela reflexão da onda acústica na interface entre a solução e o ar acima dela. Duck, 1998 ) O monte de fluido foi então alinhado no plano xy ao centro de um retículo em uma ocular do microscópio de dissecação e, após adicionar ACSF adicional e a amostra de tecido à câmara, o centro do retículo foi alinhado com a região de o tecido visado para gravação patch-clamp. A intensidade do ultrassom (50 W / cm 2) é o pico espacial, intensidade média do pulso para o campo livre. O intervalo entre as aplicações do ultrassom foi de pelo menos 12 s.

Eletrofisiologia

As gravações do clamp atual foram realizadas usando um amplificador Axon Instruments Axoclamp-2B operando no modo "Bridge" e um digitalizador Digidata 1330A com software pClamp (Molecular Devices), exceto para os experimentos preliminares na Fig. S1, que foram realizados com um Axon Instruments Axopatch Amplificador 200B (dispositivos moleculares). A gravação de patch-clamp foi realizada usando uma abordagem de "patch cego" (Blanton et al., 1989 Malinow e Tsien, 1990 Castañeda-Castellanos et al., 2006), em que a pipeta de gravação foi posicionada acima da camada CA1 do hipocampo , conforme identificado visualmente em baixa ampliação e, em seguida, abaixado lentamente no tecido enquanto aplica pressão positiva à pipeta e monitora a resistência da ponta da pipeta no modo de pinça de voltagem. Na abordagem de patch cego, uma pequena diminuição na resistência da ponta é usada para indicar possível contato da ponta da pipeta com um neurônio na ausência das pistas visuais usuais. Normalmente, os dois primeiros casos de possível contato celular não foram usados, para evitar manchas nas células na superfície do tecido que podem ter sido danificadas durante o procedimento de corte. Os Gigaseals e a configuração subsequente de gravação de célula inteira foram obtidos seguindo o procedimento padrão no modo de fixação de tensão antes de alternar para o modo de fixação de corrente. Na maioria dos experimentos, as fatias foram mantidas no lugar com uma âncora de fatia Warner Instruments RC-22 (Harvard Bioscience). Os experimentos na Fig. S1 e alguns dos experimentos na Fig. 1 E foram realizados sem uma âncora de fatia. Nenhum efeito óbvio da âncora de corte na resposta do ultrassom foi observado. A resistência da série, monitorada e compensada ao longo da gravação, estava entre 30 e 100 MΩ. Todos os neurônios usados ​​para experimentos podem ser inequivocamente identificados como células piramidais por seus padrões de disparo adaptativos distintos em resposta a etapas de corrente de 2 s. Os registros atuais foram filtrados em passa-baixa em 10 kHz e amostrados em 100 kHz. Fatias de cérebro foram continuamente perfundidas com ACSF (em mM: 119 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 MgSO4, 2,5 CaCl2, 1 NaH2PO4, 26,2 NaHCO3, e 11 glicose), borbulhado com 95% de O2/ 5% CO2, a -100–250 ml / h. A solução interna era (em mM) 126 K-gluconato, 4 KCl, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 0,3 Na2-guanosina trifosfato, 10 Na-fosfocreatina, 10 sacarose e 50 U / ml de creatina fosfoquinase (porcina), pH 7,2 (KOH). Esta solução interna contém um sistema de regeneração de ATP (fosfocreatina e creatina fosfoquinase) porque descobrimos que a força da resposta ao ultrassom era instável, diminuindo gradualmente ao longo do registro, a menos que o sistema de regeneração de ATP fosse incluído (Fig. S2) . A Na-fosfocreatina foi obtida na Abcam e a creatina fosfoquinase foi obtida na EMD Millipore. Todos os outros sais e produtos químicos foram obtidos da Sigma-Aldrich ou da Thermo Fisher Scientific (para alguns dos registros preliminares mostrados na Fig. 1 E, a creatina fosfoquinase foi omitida da solução interna, ou uma solução interna diferente, contendo [em mM ] 120 K-gluconato, 40 HEPES, 5 MgCl2, 0,3 Na2-guanosina trifosfato e 2 Na2Foi usado ATP, pH 7,2 [KOH]. A creatina fosfoquinase também foi omitida nas experiências da Fig. S4. Além da redução da resposta do ultrassom ao longo do tempo na ausência de creatina fosfoquinase, nenhuma diferença óbvia nos registros com diferentes soluções internas foi observada). Como a creatina fosfoquinase aumenta a viscosidade da solução, dificultando a obtenção de gigaseals, um pequeno volume de solução interna sem a enzima foi adicionado à ponta da pipeta (o suficiente para preencher aproximadamente os primeiros 3 mm da ponta) antes de voltar encher a pipeta com a solução que contém a enzima. As pipetas foram retiradas de vidro de parede espessa e tinham resistências entre 5 e 10 MΩ. Os registros foram realizados em temperatura ambiente (21–23 ° C), exceto para os experimentos na Fig. S4, que foram realizados próximo à temperatura fisiológica (30 ° C). Para esses experimentos, a temperatura da solução externa foi regulada e monitorada com um controlador de temperatura bipolar Warner Instruments CL-100 equipado com um aquecedor / resfriador em linha SC-20 e um termistor (Warner Instruments). A solução externa foi aquecida a 35-37 ° C enquanto era borbulhada com 95% de O2/ 5% CO2 e então passado através do aquecedor / resfriador e resfriado para atingir a temperatura alvo de 30 ° C na solução de banho (A solução externa foi resfriada em vez de aquecida para evitar a perda de tensão de oxigênio e formação de bolhas de gás devido ao aquecimento do oxigênio saturado solução).

Análise de dados

Os registros atuais foram analisados ​​no Igor Pro (Wavemetrics) com procedimentos escritos pelo usuário. O limite do potencial de ação foi definido como o ponto em que a primeira derivada da tensão atingiu 4% de seu valor de pico durante a fase de subida do potencial de ação. Este critério quantitativo foi previamente encontrado para corresponder aos limites do potencial de ação conforme identificados visualmente (Khaliq e Bean, 2010 Yamada-Hanff e Bean, 2015), e descobrimos que ele também funciona bem com nossos dados, usando gráficos de fase para confirmar visualmente o limite valor. A altura do potencial de ação foi definida como a diferença entre o pico do potencial de ação e a tensão limite do potencial de ação. A largura do potencial de ação foi medida a 50% da altura do potencial de ação definida desta maneira. Os níveis de limite de corrente para o disparo do potencial de ação foram estimados com base em uma série de etapas de corrente em incrementos de 10-pA. Gráficos de entrada de frequência (f-i) e parâmetros de potencial de ação (altura, largura, latência e intervalos entre picos) foram determinados a partir dos valores médios de pelo menos três tentativas cada para as condições de controle e ultrassom. Os ensaios F-i foram realizados alternadamente para as condições de controle e ultrassom, com a primeira condição testada variando aleatoriamente em uma base de célula por célula.

Os traços médios para a análise dos efeitos do ultrassom no potencial de repouso da membrana e na capacitância da membrana foram derivados de pelo menos três traços de voltagem. A significância estatística foi avaliada usando Student bicaudal pareado ou não pareado t testes, com P & lt 0,05 definido como significativo. A análise estatística foi realizada no programa Microsoft Excel.

Simulações de elementos finitos

Simulações de elementos finitos foram realizadas no COMSOL (COMSOL Inc.). O domínio de simulação tinha geometria radialmente simétrica e era de 6 mm na direção axial. O domínio de simulação continha quatro camadas de materiais diferentes: uma camada inferior de água (4,2 mm de espessura na direção axial), seguida por uma camada de poliestireno (25 mícrons de espessura), seguida por uma camada de tecido cerebral (500 mícrons de espessura), seguido por uma camada superior de água (1,275 mm de espessura). A largura do domínio de simulação na direção axial foi de 1 mm (para simulação de pressão acústica e aquecimento) ou 5 mm (para simulação de deformação mecânica) na direção axial. Um arco de 940 mícrons de diâmetro por 100 mícrons de altura no limite axial inferior do domínio de simulação representou a lente de quartzo do transdutor.

Simulações de pressão acústica, aquecimento e deslocamento estático em resposta à força de radiação foram realizadas conforme descrito anteriormente (Prieto et al., 2018). Para simulação do deslocamento dinâmico do tecido em resposta à força de radiação, a fatia do cérebro foi modelada como um material viscoelástico linear incompressível (Calhoun et al., 2019), caracterizado pelo módulo de Young, coeficiente de Poisson e viscosidade de cisalhamento, carregado pela camada de fluido acima dele. O poliestireno foi modelado como um material elástico linear, pois determinamos em uma série de simulações que a inclusão da viscosidade do poliestireno não afetou o deslocamento do tecido. Um intervalo de tempo de 0,1 ms foi usado para simulação do deslocamento dinâmico do tecido. As propriedades dos materiais usados ​​para água, poliestireno e tecido cerebral usados ​​na simulação e as fontes para esses valores são fornecidas na Tabela 1. Detalhes adicionais sobre o tamanho da malha, condições de contorno e configurações do solucionador estão disponíveis em Prieto et al. (2018).

Material suplementar online

A Fig. S1 mostra o efeito do ultrassom em diferentes intensidades na frequência de disparo do potencial de ação. A Fig. S2 mostra a estabilização da resposta ao ultrassom por um sistema regenerador de ATP na solução interna. A Fig. S3 mostra o efeito do ultrassom na altura do potencial de ação. A Fig. S4 mostra os efeitos do ultrassom no disparo do potencial de ação e na forma de onda próxima à temperatura fisiológica (30 ° C).


Introdução

A exocitose rápida de neurotransmissores químicos de pequenas vesículas sinápticas é a base primária para a comunicação entre os neurônios. A despolarização do potencial de ação é conhecida por ativar canais de Ca 2+ dependentes de voltagem (VGCCs) em regiões especializadas de "zona ativa" (AZ) do terminal nervoso, com o influxo subsequente de íons Ca 2+ fornecendo um gatilho local para a fusão de vesículas sinápticas com a membrana plasmática (Llinas et al., 1995). Na maioria das sinapses, e em zonas ativas individuais dentro da junção neuromuscular da rã, a liberação do transmissor é um evento estocástico de baixa probabilidade (Katz, 1969). Acredita-se que essa característica do processo de liberação seja essencial para o funcionamento normal do cérebro (Goda e Sudhof, 1997).

Na maioria dos terminais nervosos, as zonas ativas são organizadas em pequenas estruturas semelhantes a discos & lt0,5 μm de diâmetro (Edwards, 1995). Este tamanho pequeno, junto com o influxo de Ca 2+ ocorrendo dentro de 1 mseg após um potencial de ação invadir o terminal nervoso, torna difícil estudar em detalhes a distribuição espacial da entrada de Ca 2+. Por essas razões, muitos experimentos que abordam o influxo de Ca 2+ durante os potenciais de ação única mediram as elevações médias de tempo e volume em Ca 2+ integrado ao longo de terminais pré-sinápticos inteiros. Um aumento relativamente constante no Ca 2+ intracelular, em resposta a potenciais de ação únicos, foi relatado em locais sinápticos em culturas de neurônios corticais de ratos (MacKenzie et al., 1996) e em terminais pré-sinápticos em fatias cerebelares de ratos (Forti et al., 2000). Em neurônios colliculares superiores de ratos, a liberação do transmissor flutuou amplamente, mesmo quando os testes foram comparados com relação à magnitude do influxo total de Ca 2+, sugerindo que existe uma fonte significativa de variabilidade na liberação do transmissor a jusante da entrada de Ca 2+ (Kirischuk et al., 1999). A extensão espacial de transientes de Ca 2+ evocados por potencial de ação único tem sido um foco de estudo na sinapse da lula gigante (Llinas et al., 1992 Smith et al., 1993), terminais nervosos motores de lagarto (David et al., 1997 ), e junções neuromusculares de sapo embrionário em vitro (DiGregorio e Vergara, 1997 DiGregorio et al., 1999). Esses estudos identificaram gradientes espaciais no influxo de Ca 2+, mas o fizeram em preparações em que era difícil detectar heterogeneidade no influxo de Ca 2+ com resolução de zona subativa. Apesar de algumas evidências em contrário (Llinas et al., 1994 Freguelli e Malinow, 1996), muitos acreditam que um potencial de ação normalmente leva a uma inundação uniforme de zonas ativas com Ca 2+ (Sudhof e Scheller, 2001), de modo que liberam os locais são desencadeados pela sobreposição de domínios de Ca 2+ à medida que 70-90% dos canais de Ca 2+ disponíveis se abrem (Borst e Sakmann, 1998 Bischofberger et al., 2002).

Ao contrário das sinapses usadas para os estudos descritos acima, o terminal nervoso motor da rã adulta apresenta uma longa série de grandes zonas ativas organizadas como matrizes lineares (Heuser et al., 1974 Pumplin et al., 1981 Pawson et al., 1998) . Cada zona ativa tem ∼1 μm de comprimento, com as zonas ativas espaçadas como dormentes de ferrovia em intervalos regulares de 1 μm ao longo do comprimento do terminal nervoso. Dentro de cada zona linear ativa, há ∼30 vesículas sinápticas associadas estreitamente com uma fileira paralela dupla de partículas intramembrâneas que se presume incluir canais de Ca 2+ dependentes de voltagem (Pumplin et al., 1981 Robitaille et al., 1993). Neste estudo, aproveitamos o tamanho e a ordem estrutural das zonas ativas na junção neuromuscular da rã adulta, em combinação com imagens de fluorescência de alta velocidade, para examinar a distribuição espacial dos locais de influxo de Ca 2+ dentro de uma zona ativa durante a ação única potenciais.


Agradecimentos

Olaf S. Andersen atuou como editor.

Agradecemos aos pesquisadores principais e membros dos laboratórios Baccus, Butts-Pauly e Huguenard pelas discussões úteis. Agradecemos a Mike Menz e Stephen Baccus pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos a Marianna Kiraly, Dong Li e Jason Clark pela ajuda com a preparação e gravação da fatia do hipocampo. Agradecemos ao laboratório Stephen Boxer (Departamento de Química, Stanford University, Stanford, CA) por compartilhar seu limpador de plasma.

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant R01 EB019005 (para M. Maduke e B. Khuri-Yakub) e pelo National Institutes of Health Brain Research through Advancing Innovative Neurotechnologies (BRAIN), iniciativa R01 NS11215 (para M. Maduke e B. Khuri -Yakub) e pela Fundação Mathers (para M. Maduke) e conceder MH111768 (para D. Madison).