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A fixação de metanol deforma as células em cultura?

A fixação de metanol deforma as células em cultura?


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Eu uso a fixação de metanol (@ -20⁰C por 10 minutos) ao realizar ensaios de imunofluorescência em células em cultura. De um modo geral, isso resulta em uma coloração de anticorpo muito boa. No entanto, as células tendem a parecer muito diferentes do que eram na microscopia de contraste de fase antes da fixação. Isso tem preocupado meu PI sobre como essas imagens serão recebidas pelos revisores.

Como funciona um fixador de metanol e por que causa uma mudança na morfologia celular? Existem parâmetros que podem ser ajustados para mitigar esse efeito?


Sim, a fixação de quase qualquer tipo pode ter efeitos na morfologia. Quando você pega uma bolha de gordura de fluxo livre e enriquecida com proteína (isto é, membrana celular) e a torna rígida, você obterá algumas diferenças.

Uma visualização divertida disso pode ser feita envolvendo uma pipeta sorológica em celofane / filme retrátil e mergulhando-a em um banho de gelo seco e metanol. É algo que mostro aos alunos o tempo todo, antes de entrar no trabalho de histologia.

Volte para o que você precisa. Quais células você está usando e em que as está cultivando? Você já tentou a fixação com acetona e sabe que isso destruiu seu plástico? A quantidade de tempo e concentração necessária para a fixação de acetona é baixa o suficiente para que a maioria das lâminas de câmara modernas possam lidar com isso. Você precisa que a membrana seja permeabilizada na fixação?

Não sei o efeito principal que você está medindo, mas presumindo que você tenha bons controles, deve ser capaz de vê-lo além da fixação. O efeito em seus controles deve ser semelhante ao de seus grupos tratados, a menos que o tratamento seja efetuado especificamente por seu fixador.

Passando para algumas recomendações mais gerais. Acho que você deveria reconsiderar o fixador que você descartou, porque não tenho certeza sobre sua aplicação. A fonte básica que sempre recomendo aos alunos é o livro Wiley "Current Protocols in X", que é relevante para a tarefa em questão. Nesse caso, acho que o texto mais relevante é Protocolos Atuais em Imunologia, e a unidade apropriada é 21.4 "Imuno-histoquímica."

Acho que uma questão particularmente útil e relevante para essa questão se você está preocupado com o mascaramento com formalina é a Tabela 21.4.3.

Isso é para antígenos humanos, mas o processo de “recuperação de antígenos” funciona para células murinas na maioria dos casos. Você está certo ao dizer que seu antígeno pode ser bloqueado pela formalina, mas a solução geralmente é desmascaradora, pois os MtOH costumam ser mais severos com a morfologia. Para suportar o protocolo 1:

Proteína de ligação cruzada de fixação de formalina ou paraformaldeído, muitas vezes tornando os antígenos inacessíveis a anticorpos específicos. O protocolo de recuperação de antígeno, que combina alta temperatura com tampões em diferentes pH, tem sido muito eficaz em desmascarar determinantes antigênicos que podem ser mascarados em tecidos fixos ou preparações de células fixas, particularmente determinantes dentro do núcleo ou citoplasma (Taylor e Shi, 2013).

Minha modificação do protocolo é:

Tampão de citrato de sódio: ácido cítrico 0,1 M / citrato de sódio 0,1 M, pH 6,0

  1. Lave a amostra em um balancim de forro por 5 min com 2x o volume de cultura de di.i. H2O
  2. Coloque suas lâminas em tampão de citrato de 1 mM em potes Coplin com a tampa ligeiramente aberta
  3. Pese o frasco no estado final para que você saiba quanta água adicionar de volta
  4. Microondas 4-7 min. Você não quer que ferva, e você precisa se lembrar de permitir a ventilação
  5. Pese o frasco novamente e adicione água de volta
  6. Microondas por mais 4-7 min, mais uma vez, você não quer ferver
  7. Retire do forno e deixe-o atingir a temperatura ambiente, sentando-o no banco. Se você fizer isso rápido demais, irá romper a membrana.
  8. Depois de voltar à temperatura ambiente, lave 2x PBS + 0,05% Tween20 por 10 min cada
  9. Tente seu IHC novamente, provavelmente funcionará agora.

Comparação de protocolos de fixação para células cultivadas aderentes aplicadas a uma proteína de fusão GFP do receptor do fator de crescimento epidérmico

A análise da distribuição subcelular de proteínas é essencial para o entendimento de processos como a transdução de sinais. Na maioria dos casos, a análise paralela de vários componentes requer fixação e marcação por imunofluorescência. Portanto, é necessário verificar se o procedimento de fixação preserva a distribuição da proteína in vivo. As proteínas de fusão com a proteína fluorescente verde (GFP) são ferramentas ideais para esse propósito. No entanto, deve-se considerar aspectos específicos da formação ou degradação do fluoróforo, ou seja, reações que podem interferir na detecção de proteínas de fusão GFP.

Métodos:

As proteínas de fusão do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) com GFP, bem como GFP livre, solúvel, estavelmente ou transitoriamente expresso em células aderentes cultivadas serviram como casos de teste para comparar a distribuição in vivo com aquela após a fixação por epifluorescência convencional e microscopia de varredura a laser. A imunofluorescência indireta foi empregada para comparar as distribuições do sinal GFP e do polipeptídeo GFP na proteína de fusão.

Resultados:

A fixação de paraformaldeído (PFA) com subsequente montagem no agente antifading Mowiol, mas não em solução salina tamponada com Tris- ou HEPES, levou a uma redistribuição parcial do EGFR da membrana plasmática para a região perinuclear. A redistribuição foi confirmada com a imunofluorescência GFP e EGFR. A distribuição in vivo em células montadas em Mowiol foi preservada se as células foram tratadas com um procedimento combinado de fixação de PFA / metanol, que também reteve a fluorescência de GFP solúvel. O anti-soro anti-GFP foi negativo para a proteína de fusão N-terminal.

Conclusões:

O protocolo combinado PFA / metanol é universalmente aplicável para a fixação de transmembrana e proteínas citoplasmáticas solúveis e preserva a fluorescência de GFP. Cytometry 35: 353–362, 1999. © 1999 Wiley-Liss, Inc.


Introdução

As células-tronco pluripotentes (PSCs), incluindo células-tronco embrionárias (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), são uma grande promessa na medicina regenerativa, modelagem de doenças e terapias celulares 1,2,3. Para a cultura de PSCs, tanto mitomicina C (MMC) ou fibroblastos embrionários de camundongos tratados com radiação gama (MEFs) foram comumente usados ​​como células alimentadoras para manter a autorrenovação e pluripotência 4,5,6. Recentemente, células-tronco com potencial expandido / estendido (EPSCs) que contribuem tanto para o embrião adequado quanto para o trofoblasto da placenta em quimeras, também foram estabelecidas e cultivadas em células alimentadoras de MEF 7,8. As razões especuladas para o uso de MMC-MEFs foram devido ao fato de que MEFs podem produzir e secretar fatores de crescimento, incluindo fator inibidor de leucemia (LIF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e proteína morfogenética óssea (BMP) etc. 9,10,11, para manter PSCs no estado pluripotente ingênuo. No entanto, havia muitas inadequações no uso de MMC e tratamento de radiação de células alimentadoras de MEF. Em primeiro lugar, a preparação de MEFs é um processo complexo e demorado 12,13. Em segundo lugar, o MMC é caro e o MMC residual pode produzir efeitos citotoxicológicos nas ESCs 14. Além disso, a aplicação de radiação gama requer equipamentos e dispositivos especiais 15. Terceiro, os MEFs derivados de animais retêm os componentes xenogênicos que limitam sua aplicação em cultura de PSCs humanos que podem ser usados ​​para tratar doenças humanas debilitantes 16,17. Portanto, os sistemas de cultura sem alimentador são as abordagens alternativas para substituir as células alimentadoras MEF. Placas de cultura revestidas com macromoléculas recombinantes e sintetizadas, incluindo gelatina 18, Matrigel 19, proteínas de matriz extracelular recombinante 20,21,22, polímeros sintéticos 23,24, hidrogel 25,26, substrato de E-caderina recombinante 27, Glicosaminoglicano 27 e Oligopeptídeo 28, bem como o andaime 3D 28,29,30, foram desenvolvidos e usados ​​para cultivar PSCs. No entanto, esses métodos usam produtos de origem animal que podem ter problemas potenciais em aplicações de transplante ou precisam de fatores de crescimento e meios especiais.

Recentemente, relatórios mostraram que os produtos químicos glutaraldeído (GA) e formaldeído (FA) foram capazes de fixar células alimentadoras que eram usadas para manter a pluripotência de PSCs de camundongos e humanos 31,32,33. Os procedimentos de fixação química com GA e FA necessários para lavar os resíduos de GA e FA por PBS por várias vezes e, em seguida, as células fixadas podem ser armazenadas a 4 ° C ou liofilizadas primeiro e armazenadas em temperatura ambiente para uso posterior 31, 32,33. O conceito de princípio de fixação de GA e FA de células de alimentação pode fornecer um método conveniente para substituir o método tradicional de fazer células de alimentação.

A matriz extracelular (MEC) influencia a adesão, migração, diferenciação e proliferação de células-tronco por meio da comunicação com receptores de superfície celular e moléculas de adesão, como as integrinas 34,35,36. As células alimentadoras fixadas com metanol, que são incapazes de produzir fatores de crescimento e citocinas que as PSCs requerem, ainda retêm as proteínas da ECM na superfície das células fixas e fornecem nichos e sinalização para que as PSCs controlem o equilíbrio entre a autorrenovação e a diferenciação. A colagenase-IV é uma das metaloprotinase da matriz, que degrada proteínas da MEC, como colágeno IV, fibronectina, laminina e vitronectina 37. Assim, o tratamento da colagenase-IV é capaz de remover o colágeno-IV e a fibronectina da superfície das células alimentadoras fixadas em metanol. Consequentemente, a pluripotência e a capacidade de adesão das PSCs podem ser afetadas quando as células são cultivadas nas células alimentadoras fixadas com metanol tratadas com colagenase-IV.

Neste estudo, desenvolvemos um novo método para manter a autorrenovação e a pluripotência do PSC para a expansão de longo prazo. As células alimentadoras fixadas com metanol não foram usadas apenas para cultivar células-tronco pluripotentes de camundongos, humanos e porcinos, mas também para triagem resistente a antibióticos e uso repetido. Enquanto isso, demonstramos que as proteínas ECM colágeno-IV e fibronectina foram cruciais para a fixação de PSCs e manutenção de pluripotência de estado ingênuo de PSCs.


Solventes orgânicos

Os solventes orgânicos fixam as amostras por meio de um método de desidratação, que precipita proteínas e extrai lipídios. As soluções orgânicas mais comuns usadas para fixação de amostras são metanol, etanol e acetona. A fixação de metanol pode ser realizada com metanol gelado em apenas alguns minutos com células em cultura e tem o benefício adicional de permeabilização da célula. A outra vantagem é que os álcoois são muito mais seguros para uso em laboratório do que os aldeídos.

As desvantagens do uso de solventes orgânicos são que eles podem extrair proteínas citosólicas ou nucleares, e a amostra passa por um ciclo de desidratação e reidratação, que pode romper organelas e a estrutura celular geral.


Comparando agentes de fixação: metanol vs acetona para IF

A imunofluorescência é uma técnica poderosa que usa anticorpos marcados com fluorescência para detectar antígenos alvo, mas a escolha do método de fixação pode fazer uma grande diferença nos resultados obtidos.

Quando fixamos as células, o objetivo é manter a estrutura o mais próximo possível do estado nativo, mas também permitir que os anticorpos acessem seus antígenos.

Existem dois grupos principais usados ​​para fixação por imunofluorescência. Estes são os fixadores de aldeído e solventes orgânicos. Em muitos casos, o método de reticulação usando fixadores de aldeído é preferível, pois preserva melhor a estrutura celular, mas também pode haver uma redução na antigenicidade, o que significa que nem sempre é esse o caso.

Isso ocorre porque os próprios antígenos também são reticulados, evitando que seu anticorpo reconheça os antígenos. Para evitar problemas devido à reticulação, você pode usar solventes orgânicos ou uma etapa de permeabilização após a fixação com aldeídos.

Nesta postagem do blog, veremos as principais diferenças que você pode esperar ao usar dois dos solventes orgânicos mais comuns - metanol e acetona # 8211.

Primeiro, como funcionam os solventes orgânicos?

O metanol e a acetona atuam por desidrogenação e precipitação de proteínas, fixando assim as proteínas. Isso significa que as células se tornam instantaneamente permeabilizadas.

Começando pelo metanol, vamos dar alguns pontos positivos e negativos para o uso de solventes orgânicos como fixadores e detalhes de quando você deve usá-los.

O metanol é mais comumente usado para fixar seções congeladas, células de cultura de células ou esfregaços.

Preservação da arquitetura celular.

Seções e células de tecido congeladas.

Estabilizando a estrutura secundária de proteínas.

Evitando problemas com reticulação formaldeyhde.

Efeito forte em muitos epítopos

Componentes solúveis em água e lipídios podem ser perdidos.

Afeta as proteínas de estrutura terciária

Quando devo usar metanol?

Você deve usar metanol quando estiver tentando visualizar antígenos em microtúbulos.

Mais alguma coisa que eu deva saber?

O metanol é freqüentemente usado a -20 ° C. As razões para isso são diversas, variando de imagens de imunofluorescência mais nítidas a maior controle sobre o processo, pois a fixação com metanol é um processo rápido e se você não usar nessa temperatura baixa pode acabar sem lipídios suficientes para reter qualquer estrutura.

Um forte agente desidratante, pode causar precipitação irreversível de proteínas do tecido.

Às vezes, menos prejudicial aos epítopos.

Os componentes solúveis e lipídicos são perdidos.

Quando devo usar acetona?

Para melhor preservação histológica do que o metanol.

Para conservar epítopos em um grau mais alto.

Mais alguma coisa que eu deva saber?

A acetona vai permeabilizar e nenhuma outra etapa de permeabilização precisa ser realizada.

A acetona também deve ser usada em -20.

Que tal usar metanol e acetona juntos?

Também é importante notar que uma combinação de metanol e acetona pode ser usada devido à acetona ser menos prejudicial aos epítopos. A acetona é usada em tecidos congelados rapidamente, precipitando-os e, em seguida, o metanol é usado para consertar.

Às vezes, a acetona é usada após o metanol como uma etapa de desidratação adicional.

Quais são seus pensamentos e experiências sobre o uso da imunofluorescência com metanol e acetona? Comente abaixo ou envie um tweet para nós em @CiteAb.

& # 8211 Eleanor e a equipe CiteAb

Se você quiser saber mais, aqui estão algumas sugestões de leitura adicional:

Procure anticorpos para uso em IF no CiteAb [link]

Sistemas R & ampD: fixação adequada de amostras IHC / ICC [link]

Bitesize Bio: Fixação de células e tecidos 101 [Link]

Laboratório de ciências: como preparar seu espécime para imunofluorescência [link]

Cytometry @ Leeds: Otimizando as condições de fixação de células para imunofluorescência [Link]


Capítulo 19 Imunofluorescência de sobreposição de ágar: estudos de alta resolução dos componentes do citoesqueleto e suas alterações durante a quimiotaxia

Este capítulo descreve o método de sobreposição de ágar que supera dois problemas principais enfrentados pela imunofluorescência convencional. Estes são (1) redução drástica e / ou deformação das células causada pela fixação de formaldeído, e (2) resolução insuficiente devido à sobreposição da fluorescência devido à forma redonda ou cilíndrica do Dictyostelium células. Esses problemas são superados achatando as células vivas com uma sobreposição de uma fina folha de agarose enquanto se conduz a fixação instantânea com metanol absoluto frio. Esse procedimento resulta em células com 1–2 pm de espessura e 20-30 pm de largura e auxilia na orientação das estruturas filamentosas em paralelo ao plano focal. Usando anticorpos monoclonais de alto título, distribuições específicas de actina, miosina e tubulina são descritas em Dictyostelium. É mostrado que os filamentos de miosina mudam transitoriamente sua distribuição, respondendo a um estímulo quimiotático de maneira dinâmica. A imunofluorescência de “sobreposição de agar” parece ser geralmente útil para células não musculares de vertebrados pequenos e redondas e de organismos inferiores. Essa técnica pode fornecer informações valiosas sobre as características dinâmicas e a organização detalhada dos elementos do citoesqueleto que, de outra forma, não podem ser visualizados com resolução suficiente.


Descrição

A análise de eventos de sinalização dentro de células individuais com imagens de microscopia tem várias vantagens em relação às técnicas que não são de imagem. A principal vantagem da citometria de imagem em relação aos ensaios de leitor de placa e até mesmo outras técnicas de célula única, como a citometria de fluxo, é o potencial para coleta de informações morfológicas e espaciais em escalas de comprimento subcelular e supracelular. Isso pode ser uma vantagem para os ensaios baseados em células para triagem de citotoxicidade de drogas, onde até mesmo medições morfológicas relativamente simples, como a área do núcleo, mostraram ser preditivas do resultado clínico. A citometria de imagem pode coletar informações espaciais em várias centenas de células aderentes, bem como fornecer quantificação de sinal em células aderentes individuais e quantificação das diferenças entre as células na população. Nós examinamos a viabilidade de desenvolver um ensaio quantitativo de imunofluorescência baseado em células para a fosforilação da cadeia leve da miosina, sendo a miosina um importante intermediário de muitos processos celulares vitais, incluindo a divisão celular.

Para aproveitar os benefícios da microscopia, era importante preservar a morfologia geral da amostra e, ao mesmo tempo, obter um sinal ideal para a fosforilação da cadeia leve da miosina. Primeiro, usamos a morfologia geral da célula como critério qualitativo para rastrear várias técnicas de fixação. Testamos quatro reagentes de fixação diferentes: etanol (EtOH), metanol (MeOH), acetona (Ac) e paraformaldeído (PFA). O PFA preservou melhor a morfologia celular, enquanto os solventes orgânicos etanol, metanol e acetona deram resultados variáveis ​​como fixadores e, em alguns casos, causaram o arredondamento das células após a adição de qualquer um dos três solventes (dados não apresentados). PFA foi selecionado como o reagente de fixação, e quatro métodos diferentes de permeabilização foram selecionados para selecionar a estratégia de permeabilização ideal. Após a fixação por PFA à temperatura ambiente, as células foram permeabilizadas com metanol (PFA + MeOH, 4 ° C), etanol (PFA + EtOH, 4 ° C), acetona (PFA + Ac, 4 ° C) ou triton X-100 em PBS (PFA + TX100, temperatura ambiente). Também testamos um procedimento simultâneo de fixação e permeabilização incluindo 0,5% de triton X-100 na solução de PFA (PFATX, temperatura ambiente). A presença de coloração de anticorpo fosfo-MLC ao longo de fibras de estresse de f-actina bem definidas foi usado como o critério para avaliar o método de permeabilização. Cada uma das diferentes técnicas de permeabilização resultou em diferenças distintas nos padrões de coloração. Com base nos critérios acima, PFATX foi considerado ideal entre os métodos testados para preservar a fosforilação da cadeia leve da miosina e as fibras de estresse de actina.

Usando esta técnica de fixação de espécime, a fosforilação da cadeia leve da miosina foi medida em função do aumento das concentrações de uma droga que inibe a fosforilação de MLC e os valores resultantes foram comparados com medições semelhantes feitas por Western blotting e consideradas equivalentes. O ensaio foi ainda validado por um método adicional para fosforilação MLC perturbada, incluindo a alteração da densidade de ECM, ativação da fosforilação da miosina e realização do ensaio em um tipo de célula diferente. Um componente chave desta atividade foi a disponibilidade de uma infraestrutura desenvolvida anteriormente no NIST para marcar e segmentar corpos celulares usando uma coloração de alto contraste e instrumentação para microscopia automática.


Notas de rodapé

Isenção de responsabilidade do editor: Este é um arquivo PDF de um manuscrito não editado que foi aceito para publicação. Como um serviço aos nossos clientes, estamos fornecendo esta versão inicial do manuscrito. O manuscrito passará por revisão, composição e revisão da prova resultante antes de ser publicado em sua forma final citável. Observe que, durante o processo de produção, podem ser descobertos erros que podem afetar o conteúdo, e todas as isenções de responsabilidade legais que se aplicam à revista pertencem.


Protocolos de Ensaio de Migração e Invasão de Célula Endotelial Transwell

Protocolo de Ensaio de Transmigração

1. Prepare uma cultura de células endoteliais. Placa de células endoteliais PromoCell em 5X10 3 células / cm 2 (ou conforme recomendado no respectivo manual do produto) em um recipiente de cultura adequado usando o meio de crescimento endotelial recomendado. Substitua o meio de cultura a cada 2-3 dias. Permita que as células atinjam uma confluência de 70-90%.
2. Prepare o meio de ensaio. Prepare uma quantidade apropriada de meio de ensaio adicionando 10% de FBS ao meio basal de células endoteliais (por exemplo, 9 mL de meio basal + 1 mL de FBS).
3. Ajuste a mídia e os reagentes à temperatura ambiente. Pré-aqueça o meio de ensaio e os componentes do PromoCell DetachKit à temperatura ambiente durante 1-2 horas.
4. Prepare o meio de teste. Dissolva a substância de teste no meio de ensaio. 750 μL do meio de teste devem ser usados ​​por poço da placa de 24 poços. Recomendamos preparar um meio de teste adicional com 20 ng / mL de VEGF ou bFGF para ser usado como controle positivo. Como meio de ensaio de controle negativo sem qualquer fator quimiotático pode ser usado.
5. Prepare placas de 24 poços e adicione meio de teste. Coloque inserções de cultura de células nos poços da placa de 24 poços. Adicione 750 μL de meio de teste ao compartimento externo de cada poço.
6. Destacar células endoteliais. As células endoteliais devem ser 70-90% confluentes. Remova o meio do recipiente de cultura e lave as células adicionando 200 μL / cm 2 de PBS (D8537). Remova o PBS e adicione 100 μL / cm 2 de Tripsina / EDTA (T3924). Feche o vaso e examine as células ao microscópio. Quando as células começarem a se desprender, bata suavemente na lateral do vaso para soltar as células restantes. Neutralize a solução de tripsina adicionando 100 μL / cm 2 de solução de neutralização de tripsina (T6414) e agite suavemente o recipiente de cultura por 30 segundos.
7. Contar as células. Transfira a suspensão de células para um tubo de centrífuga e gire o tubo a 220 x g por 4 min em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio de ensaio. Determine o número da célula de acordo com seu procedimento padrão.
8. Semeie as células nas inserções de cultura de células. Diluir a concentração de células para 1x 10 5 células / mL com meio de ensaio. Adicione cuidadosamente 500 μL da suspensão de células (= 5X10 4 células) nas inserções de cultura de células na placa de 24 poços.
9. Iniciar experimento de transmigração. Incube as células nas inserções da placa de 24 poços em uma incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO2) por 3-6 horas. Durante o tempo de incubação, um gradiente da substância em estudo se desenvolve através da membrana. As células migram através dos poros ao longo do gradiente para o lado inferior da membrana e aderem lá.
10. Remova as células não migradas na parte superior da membrana. Remova cuidadosamente o meio de todas as inserções de cultura de células. Em seguida, remova os insertos com uma pinça e aspire o meio de cada poço. Depois de retornar as inserções para o poço, remova as células não migradas na parte superior da membrana usando um cotonete. Pipete PBS no espaço entre o poço e a inserção.
11. Prossiga com a fixação e coloração das células migradas.

Protocolo de Ensaio de Invasão

1. Prepare uma cultura de células endoteliais. Plate PromoCell Endothelial Cells a 5X10 3 células / cm 2 em um recipiente de cultura adequado usando o meio de crescimento endotelial recomendado. Substitua o meio de cultura a cada 2-3 dias. Permita que a célula alcance 70-90% de confluência.
2. Prepare as câmaras de ensaio de invasão e ajuste a mídia e os reagentes às temperaturas adequadas. Prepare uma quantidade apropriada de meio de ensaio, adicionando 10% de FBS ao meio basal de células endoteliais (por exemplo, 9 mL de meio basal + 1 mL de FBS). Adicione 750 μL de meio de ensaio a cada poço e 500 μL de Matrigel / ECM Gel à inserção de cultura de células. Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO2) por 1-2 horas.
3. Prepare o meio de teste. Dissolva a substância de teste no meio de ensaio. 750 μL do meio de teste devem ser usados ​​por poço da placa de 24 poços. Recomendamos preparar um meio de teste adicional com 20 ng / mL de VEGF ou bFGF para ser usado como controle positivo. Como meio de ensaio de controle negativo sem qualquer fator quimiotático pode ser usado.
4. Adicione o meio de teste aos poços. Remova as inserções revestidas com Matrigel / ECM Gel dos poços da placa de 24 poços usando uma pinça e aspire o meio de ensaio de cada poço. Depois de retornar os insertos aos poços, pipete 750 μL de meio de teste no espaço entre o poço e o inserto.
5. Destacar células endoteliais. As células endoteliais devem ser 70-90% confluentes. Remova o meio do recipiente de cultura e lave as células adicionando 200 μL / cm 2 de PBS (D8537). Remova o PBS e adicione 100 μL / cm 2 de Tripsina / EDTA (T3924). Feche o vaso e examine as células ao microscópio. Quando as células começarem a se desprender, bata suavemente na lateral do vaso para soltar as células restantes. Neutralize a solução de tripsina adicionando 100 μL / cm 2 de solução de neutralização de tripsina (T6414) e agite suavemente o recipiente de cultura por 30 segundos.
6. Contar as células. Transfira a suspensão de células para um tubo de centrífuga e gire o tubo a 220 x g por 4 min em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio de ensaio. Determine o número da célula de acordo com seu procedimento padrão.
7. Semeie as células nas inserções de cultura de células revestidas com Gel Matrigel / ECM. Diluir a concentração de células para 1x10 5 células / mL com meio de ensaio. Remova o meio de ensaio das inserções revestidas com Matrigel sem tocar na superfície revestida com Matrigel. Adicione cuidadosamente 500 μL da suspensão de células (= 5X10 4 células) nas inserções de cultura de células.
8. Iniciar experimento de invasão. Incubar as células nas inserções revestidas com Matrigel em uma incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO2) por 16-28 horas. Durante o tempo de incubação, um gradiente da substância em estudo se desenvolve através da membrana. No caso de uma estimulação positiva pela substância de teste, as células degradam a matriz, migram através dos poros ao longo do gradiente para o lado inferior da membrana e aderem lá.
9. Remova as células não migradas na parte superior da membrana. Remova cuidadosamente o meio de todas as inserções revestidas de Matrigel / ECM Gel. Em seguida, remova os insertos com uma pinça e aspire o meio de cada poço. Depois de retornar as inserções para o poço, remova as células não migradas na parte superior da membrana usando um cotonete. Pipete 750 μL de PBS no espaço entre o poço e a inserção.
10. Prossiga com a fixação e coloração de células migradas.

Análise de células migradas

Fixação e coloração de células
1. Fixe as membranas e seque as inserções. Remova cuidadosamente o PBS dos poços e adicione 750 μL de metanol frio (34860) (4 ° C) aos poços. Incubar por 20 min em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o metanol e aguarde 30 minutos. Durante esse tempo, a membrana secará ao ar. Após a secagem, a membrana pode ser armazenada a 4 ° C e posteriormente processada.
2. Mancha as células. Adicione 750 μL de violeta de cristal (V5265) aos poços e incube por 20 minutos em temperatura ambiente.
3. Lave a membrana. Remova cuidadosamente a solução de coloração e lave três vezes com água destilada.
4. Prossiga com a análise.

Análise

1. Quantificação visual. Preencher 750 mL de água destilada nos poços da placa de 24 poços e contar as células migradas no local inferior da membrana usando um microscópio invertido.
2. Quantificação colorimétrica com leitor de microplaca. Encha 750 μL de ácido acético a 10% (A6283) nos poços e incube por 30 segundos enquanto agita cuidadosamente a placa de 24 poços. As células da membrana serão lisadas pelo ácido acético e a Violeta de Cristal das células será liberada. Remova o inserto da placa de 24 poços e leia a densidade óptica do ácido acético a 10% a 595 nm usando um leitor de microplaca.

Resultados

Figura 2. Migração celular in vitro de células endoteliais estimuladas por VEGF. Células que migraram através da membrana sem VEGF (esquerda) e com VEGF 20 ng / ml no meio (direita). As células são coradas com Violeta de Cristal.


Medição morfológica de células vivas em metanol com microscopia holográfica digital

A morfologia celular é a base da pesquisa em muitas aplicações relacionadas à estimativa do estado da célula, resposta a drogas e triagem de toxicidade. No campo biomédico, a detecção quantitativa de fases é uma tendência inevitável para células vivas. Neste trabalho, a alteração morfológica de células HeLa tratadas com metanol em diferentes concentrações é detectada por meio de microscopia holográfica digital. O sistema holográfico digital de plano de imagem compacto é projetado com base em elementos de fibra. A imagem de fase quantitativa de células vivas é obtida em combinação com a análise numérica. A análise estatística mostra que a área e a espessura óptica média das células HeLa tratadas com metanol 12,5% ou 25% reduzem significativamente, o que indica que o metanol com menor concentração pode causar encolhimento celular. A área das células HeLa tratadas com 50% de metanol é semelhante à das células normais

, que revela o efeito fixador do metanol em maior concentração. A espessura óptica máxima das células tratadas com metanol 12,5%, 25% e 50% é maior do que a das células não tratadas, o que implica a picnose das células HeLa sob o efeito do metanol. Todos os resultados demonstram que a microscopia holográfica digital forneceu uma alternativa de imagem não invasiva para medir a mudança morfológica de células vivas livres de marcadores.

1. Introdução

A morfologia celular intimamente relacionada às suas várias funções e atividades é a base de pesquisa da disciplina biomédica moderna e das ciências da vida. Sob a cultura de células normais, o tamanho da célula viva muda aparentemente devido à proliferação ou morte celular, e o estado de sobrevivência das células também pode ser estimado pela morfologia celular em grande medida. A apoptose, como processo de morte celular programada, desempenha um papel importante no desenvolvimento e na homeostase, sendo a alteração morfológica uma característica típica para distinguir a apoptose da necrose [1, 2]. A morfologia celular também pode revelar como as células vivas foram influenciadas por diferentes fatores ambientais ou diferentes tratamentos médicos, como drogas anticâncer [3, 4]. Além disso, em algumas doenças como diabetes mellitus, anemia ferropriva e talassemia, a morfologia celular é significativamente alterada [5, 6]. Comparando com a observação simples, a detecção de fase quantitativa para a mudança morfológica das células vivas livres de marcadores tornou-se uma demanda urgente para a pesquisa biomédica.

A microscopia óptica é um recurso importante e poderoso para o estudo biológico e médico por vários séculos. Uma vez que as células biológicas são quase um tipo de objetos transparentes chamados objetos de fase, o método de imagem de microscopia de luz baseado em intensidade convencional dificilmente fornece o contraste adequado entre as células e o ambiente. A microscopia de fluorescência necessita de agentes de contraste exógenos como rodamina, laranja de acridina, proteína fluorescente verde (GFP) para resolver o problema de contraste, que pode tornar as células vivas fototóxicas e citotóxicas e, infelizmente, influenciar o comportamento celular [7]. Para esses problemas, muitos métodos de imagem de fase óptica foram desenvolvidos para atingir a observação visual sem rótulo de células vivas. As técnicas de imagem de contraste de fase, como o microscópio de contraste de fase Zernike ou o microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC), aparentemente aumentam o contraste de objetos de fase ou semifásicos; no entanto, são abordagens inerentemente qualitativas e não podem fornecer informações quantitativas da estrutura subcelular. Portanto, várias técnicas foram desenvolvidas para obter imagens de campo total e de contraste de fase quantitativo, como microscopia de fase de Fourier (FPM), microscopia de fase de Hilbert (HPM), microscopia de fase de difração (DPM) e microscopia holográfica digital (DHM). [8–13]. Comparado com outros métodos de imagem, o DHM tem atraído mais atenção dos pesquisadores por suas vantagens particulares. O DHM pode recuperar as informações quantitativas de amplitude e fase da frente de onda do objeto a partir de um único holograma digital, o que torna possível a detecção em tempo real. Since the numerical focusing can be implemented by the wave propagation theory, DHM does not demand to strictly record the hologram in the focused image plane of the object, and the digital autofocusing algorithm can help to search the best in-focused image. Furthermore, DHM does not need any complex scanning configuration and possesses a simple setup accordingly.

The noninvasive cell imaging based on DHM has attracted more attention in the biomedical field. Rappaz et al. measured the physiological parameters of the neurons and the testate amoebae by using premagnification digital holography [12, 13]. Kemper et al. studied the invasion mechanism of the living pancreas carcinoma cells and the interaction mechanism of the anticancer drug through the dynamic detection of living cells based on DHM system [14]. Kim et al. achieved the quantitative imaging of ovarian cancer cells through the angular spectrum method. Besides, they also quantitatively studied the wrinkling of a silicone rubber film by motile fibroblasts based on digital holography [15, 16]. Jeong et al. utilized the digital holographic optical coherence imaging to track the effect of cytoskeletal anticancer drugs on tissue inside its natural 3-dimension (3D) environment using time-course measurement of motility within tumor tissue [17]. Pavillon et al. applied the digital holographic microscopy to the early and label-free detection of cell death of the mouse cortical neurons [18]. However, it is also essential to develop the effective setup of DHM and expand its new applications.

The active ingredients of many drugs that are hardly soluble in water can only be dissolved in the organic solvents with high polarity [19, 20]. Methanol, as a kind of organic solvents, is often applied to the em vitro pharmacodynamic screening. Nevertheless, the methanol solution with high concentration has toxic effects on living cells thus the methanol should be diluted to a low concentration when it is used for cell culture. In addition, the fixation of tissues and cells is a key process of immunohistochemistry. Methanol is a frequently used fixative with good penetration [21, 22]. It can remove the lipids leading to cellular dehydration, meanwhile, the proteins instantaneously precipitated on the cytoskeleton. The fixative effects of methanol terminate or reduce the response of exogenous or endogenous enzymes to prevent autolysis of the cells in order to maintain the inherent shape and structure of the tissue cells, more importantly, to preserve antigenicity, and to prevent the loss or diffusion of antigen. In this paper, HeLa cells (human cervix carcinoma cell) are used as the tested sample. The cell morphological change treated with methanol solutions of different concentration is studied by the DHM imaging system. In combination with the numerical analysis and image processing, the surface area and optical thickness of cells are calculated, and the results show that the methanol solutions with different concentrations have diverse effects on the morphology of living HeLa cells.

2. Materiais e métodos

2.1. Principle of Digital Holographic Microscopy

Digital holographic microscopy, as a quantitative phase-contrast imaging method, is essentially a kind of optical interferometry to detect the phase delay related to the light passing through the tested object. When passing through a relatively transparent sample, the intensity of the light changes very little, while the light through the sample speeds up or slows down and brings a corresponding phase change as indicated in Figure 1. The phase delay or advance depends on the relation of the refraction index between the sample and surrounding environment. Since the phase information is proportional to the optical path length called optical thickness, a depth profile of the tested sample can be calculated. Therefore, digital holography is particularly suitable to measure the phase object such as the living cells and microoptical elements.


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